凋亡相关基因PDCD5在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

张婧雯 蒋军广 翟展艺 田 蕊 刘瑞芬 杨 超 孙 曼 史 江

(郑州大学第一附属医院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

多项研究表明，肺癌的发生、发展不仅与原癌基因的激活、抑癌基因的失活导致细胞增生过度和分化异常有关，还与细胞凋亡异常有关。人程序化死亡因子5(PDCD5)是凋亡促进基因，国内外文献对PDCD5在NSCLC中表达的意义及其与细胞凋亡的关系报道较少。本实验拟探讨凋亡相关基因PDCD5在NSCLC中的表达情况及临床生物学意义。

1 对象与方法

1.1 标本 2008年1月至2009年11月在我院胸外科手术切除且病理证实为NSCLC的肺癌组织标本60例，男性35例，女性25例，年龄30～78岁，平均54岁。鳞癌22例，腺癌38例，按组织学分级:高分化10例、中分化30例、低分化20例;按照2002年美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的TNM分期标准:Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例;伴淋巴结转移27例，不伴淋巴结转移33例;病理学或影像学检查有胸膜转移26例，无转移34例。所有入选的肺癌病人术前均未接受任何抗肿瘤治疗。取20例NSCLC癌旁正常肺组织(距肿瘤边缘大于3 cm并经病理切片证实为正常肺组织)作为对照。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 TUNEL凋亡试剂盒购于美国Promega公司，POD转换剂购自美国罗氏公司，鼠抗人PDCD5单克隆抗体购于北京宝赛生物技术有限公司，S-P免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化染色 采用S-P法，主要步骤如下:石蜡切片脱蜡水化，于柠檬酸缓冲液中行微波抗原修复，过氧化物酶阻断剂双氧水阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清封闭山羊血清阻断非特异性反应，滴加一抗鼠抗人PDCD5单克隆抗体，滴加生物素标记的二抗，滴加链亲和素-过氧化物酶制剂，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

1.2.3 细胞凋亡的检测 采用TUNEL法，主要步骤如下:石蜡切片脱蜡水化，4%多聚甲醛固定，1∶500蛋白酶K工作液通透组织切片，4%多聚甲醛后固定，Buffer液平衡切片，加入孵育缓冲液标记DNA断裂链，载玻片浸入2倍SSC液终止反应，荧光显微镜下分析样品，加入POD转换剂转换，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

1.2.4 PDCD5阳性结果判定 在20×10高倍视野下，随机选取5个有阳性细胞存在的视野进行计数，每个视野计数100个细胞，共500个细胞。PDCD5以细胞质内出现棕黄色颗粒计为阳性细胞。判定方法:(1)按阳性细胞所占百分数评分:0分:0%，1分:＜10%，2分:10% ～50%，3分:＞50%。(2)按细胞染色深浅评分:无棕黄色颗粒，与背景无区别为0分;有棕黄色颗粒，明显高于背景底色为1分;有染色较清晰的棕黄色颗粒，介于强弱之间为2分;有大量的深棕色颗粒，染色强为3分。综合染色强度和阳性细胞所占百分数进行判定，即 (1)+(2):最后得分≥4分为为阳性表达(+)，＜4分为阴性表达 (－)。

1.2.5 凋亡细胞的阳性结果判定及凋亡指数(AI)的计算用TUNEL法对凋亡细胞进行检测，所测得的凋亡细胞为细胞核染成棕黄色的细胞。在40×10高倍视野下随机选取10个视野观察，计算凋亡细胞与所计数细胞总数的比值，即AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，χ2检验的连续性校正及直线相关分析。

2 结果

2.1 PDCD5在正常肺组织和NSCLC组织中的表达及其与临床病理特征的关系 60例NSCLC组织中PDCD5的阳性表达率为25.0%(15/60)，20例正常肺组织的阳性表达率为70.0%(14/20)，差异有统计学意义(χ2=13.144，P=0.000)。PDCD5阳性表达率与NSCLC分化、及淋巴结转移有关(均P＜0.05);与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤直径、病理分型、是否吸烟及有无胸膜转移无关。见表1。

表1 PDCD5在NSCLC组织中的表达与临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.2 PDCD5与细胞凋亡之间的关系 PDCD5分值0分、1～2分、3～4分、5～6分者 AI分别为:1.64±0.77、1.90±0.83、3.23±1.50、4.05±1.55。PDCD5积分与 AI呈正相关(r=0.663，P=0.000)。

3 讨论

PDCD5是一种新的程序性细胞死亡调控基因，由北京大学人类疾病基因研究中心马大龙等〔1〕首次克隆。PDCD5在组织中表达广泛，进化保守，具有促进凋亡的作用。研究表明，PDCD5在人类多种组织中表达(造血系统除外)，其表达有明显的组织特异性，在成年心脏、睾丸、肾脏、肾上腺、胎盘中显著表达，在各个胚胎组织中的表达明显下降。PDCD5定位于染色体19q12-q1311，由125个氨基酸组成，包含6个外显子和5个内含子。PDCD5全长约6 kb，cDNA全长559 bp，包括polyA和AATAA加尾信号〔1〕。PDCD5在肝癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌等肿瘤中的表达明显降低，而在自身免疫性疾病及退行性疾病中表达增加。迄今为止，PDCD5促凋亡的机制尚不很清楚。目前的研究倾向于:(1)作为caspase-3的正调控分子参与细胞凋亡，即通过结合活化的caspase-3，延长活化的caspase-3的体外半衰期，促进细胞凋亡〔1〕。(2)损伤线粒体，加速细胞凋亡，即通过线粒体膜通透性转运孔的开放及细胞色素C的释放，引起膜电位降低〔2〕。本实验与文献报道的结果一致〔3〕，提示 PDCD5的异常表达可能在NSCLC的发生、发展中起到一定作用，PDCD5有望成为新的肿瘤标记物。

PDCD5在NSCLC高分化组织中阳性表达率高于中、低分化组织，与阎红娥等〔3〕报道的结果一致，提示PDCD5有助于分化程度的分级，PDCD5阳性表达率越低，NSCLC恶性程度越高。有文献报道〔3，4〕PDCD5在NSCLC组织中的表达与临床分期有关，随着临床分期的上升表达逐渐减弱。本实验结果也提示检测PDCD5有助于TNM分期。TNM分期作为一种临床分期的标准，对肿瘤预后的判断有相当重要的价值，TNM分期愈晚，预示着肿瘤侵袭性愈高和预后不良，因此检测PDCD5可能有助于NSCLC预后的判断。本研究还发现PDCD5的表达与有无淋巴结转移有关，与孙晓坤等〔5〕在结肠癌中的研究结果一致，提示检测PDCD5有助于有无淋巴结转移的判断。

本实验通过TUNEL法测得的PDCD5积分与AI呈正相关，因此推论PDCD5在组织中的高表达促进了突变的、多余的细胞发生凋亡，抑制了肿瘤的生长。但PDCD5能否成为诊断NSCLC的肿瘤标记物及判断其预后的有效指标，还有待于更多的研究去证实。

1 马大龙.新细胞因子及细胞凋亡基因的发现与功能研究〔J〕.北京大学学报(医学版)，2002;34(5):488-92.

2 田辉凯，夏 天，蒋春笋，等.TFAR19促进小数线粒体膜通透性转运孔的开放〔J〕.生物化学和生物物理学报，2002;34(3):279-84.

3 阎红娥，毕胜传，孙云晖.人程序化死亡因子5(PDCD5)在非小细胞肺癌细胞中的表达及相关性研究〔J〕.黑龙江医药科学，2009;32(1):20-1.

4 张雪梅，刘启明，霍荣昌.PDCD5与Caspase-3在人非小细胞肺癌中的表达〔J〕.现代肿瘤医学，2010;18(8):1533-6.

5 孙晓坤.凋亡相关基因PDCD5、Survivin在结肠癌组织的表达及临床意义〔D〕.吉林大学，2008.