猪肾细胞系IBRS-2感染猪细小病毒的检测

李 斌 ，梁家幸 ，苏乾莲 ，赵 武 ，秦毅斌 ，何 颖 ，卢冰霞 ，3，段群棚 ，李莹莹 ，3，姜佳佳 ，3，梁保忠

（1.广西兽医研究所，广西南宁 530001；2.广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001；3.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005）

细胞培养始于20世纪初（Harrison 1907，Carrel 1912），现已广泛应用于生物学、医学各个领域[1]。在兽医学领域，培养细胞对于动物病毒的体外增殖培养、动物病毒疫苗的研制等都是必不可少的。猪细小病毒（porcine parvovirus， PPV）是Mary和Mahnel于1966年从猪瘟病毒组织培养中首次发现，并认为是培养细胞内潜伏感染的病毒[2]。笔者实验室长期从事动物病毒学的研究，日常进行猪肾细胞系IBRS-2、PK-15、仓鼠肾细胞BHK等细胞的培养，用于动物病毒的增殖培养。在数次猪肾细胞系IBRS-2培养过程中观察发现细胞产生类似PPV感染的病变，怀疑为PPV感染，于是应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）技术对病变细胞进行PPV核酸的检测，结果为阳性，现报告如下。

1 料与方法

1.1 出现病变的细胞

将细胞培养过程中发现类似PPV感染病变（即细胞收缩，细胞颗粒增多，折光度增强，细胞崩解，部分从瓶壁脱落）的IBRS-2细胞（图 1）－20 ℃冻融3次，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用于检测PPV核酸。

1.2 正常的细胞

细胞培养过程中未发现病变的正常IBRS-2细胞（图 2）处理方法同1.1。

1.3 细胞培养用成份

胰酶、新生牛血清、谷氨酰胺、MEM、双抗（青霉素+链霉素）均购自生化试剂药品公司；无离子水为广西康普动物保健品有限公司制备的双蒸无离子水（ddH2O）。将细胞培养所用试剂溶液－20℃冻融3次，5 000 rpm离心10 min，取上清液，用于检测PPV核酸。

1.4 PPV阳性对照

为广西兽医研究所蒋玉雯等[3，4]分离并增殖保存的PPV自然弱毒株（PPV-N株）。

1.5 PCR试剂

DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Taq酶购自Fermentas公司，dNTPs购自生工生物工程（上海）有限公司，DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司，双蒸无离子水（ddH2O）由广西康普动物保健品有限公司制备。

1.6 PCR引物设计与合成

参考赵俊龙等方法[5]，设计合成一对引物，引物序列如下，PP1：5’- cag aat cag caa cct cac-3’，PP2：5’- tgg tct cct tct gtg gta gg -3’， 预期PCR扩增产物大小为445 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.7 DNA模板的提取

将出现类似PPV感染病变的IBRS-2细胞、未出现病变的IBRS-2细胞、细胞培养所用的胰酶液、新生牛血清、谷氨酰胺液、MEM液、双抗液、ddH2O、PPV-N株，冻融3次后的离心上清液200 μL，用DNA抽提试剂盒进行DNA模板的提取，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 PCR扩增

PCR反应采用25 μL反应体系，其组成如下：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.7 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.6 μL，引物 PP1、PP2（25 μmol/L）各 0.7 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 13.4 μL，DNA 模板 5 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性4 min，进入94 ℃ 40 s， 57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环，然后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃ 终止反应。

1.9 PCR产物的检测

取 20 μL PCR 扩增产物，加入4 μL 6×Loadding Buffer，于混有EB替代物的1%琼脂糖凝胶中以120 V 100 mA电泳40 min，于紫外灯下观察电泳结果，并于凝胶成像系统拍照保存结果。

1.10 PCR产物的核苷酸序列测定

将类似PPV感染病变的IBRS-2细胞、PPV-N株的PCR扩增产物送由北京六合华大基因科技股份有限公司进行纯化、测序，获得相应的PPV扩增片段核苷酸序列。

图1 出现类似PPV感染病变的IBRS-2细胞（×400）

图2 正常IBRS-2细胞（×400）

2 结果

2.1 PCR扩增结果

在细胞培养所用的胰酶、新生牛血清、谷氨酰胺、MEM、双抗、ddH2O，及未出现PPV感染病变的2个批次IBRS-2细胞中均未检测出PPV核酸。在2个PPV阳性对照（PPV-N株），5个批次出现类似PPV感染病变的IBRS-2细胞中均检测出445 bp的PPV特异性核酸条带（图3）。

图3 PCR扩增结果

2.2 PCR产物的核苷酸序列测定结果

将类似PPV感染病变的IBRS-2细胞5个样品、PPV-N株2个样品的PCR扩增产物进行测序，获得7个样品的PPV扩增片段核苷酸序列。将这7条核苷酸序列与NCBI数据库的5株PPV参考毒株（登录号：AY583318、D00623、DQ675456、NC_001718、PPU44978）的相应核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：除了PPU44978 PPV毒株的相应核苷酸序列与其余11条PPV相应核苷酸序列的同源性均为99.5%，其余11条PPV相应核苷酸序列的同源性均为100%。

3 讨论

通过细胞病变观察、PCR检测和核苷酸序列测定，可证实本实验室数个批次培养的IBRS-2细胞被PPV感染。细胞感染PPV的可能原因有多种，最主要的原因有如下两个：（1）PPV在自然环境中广泛存在，抵抗力强，存活时间长，普通消毒方法很难杀灭[2]，所以PPV很容易污染细胞培养用的器皿、试剂，及操作者的手等，导致在细胞培养过程中PPV感染细胞；（2）某些采购的或向别的实验室引进的种细胞早期潜伏感染PPV，由于含量极其微小，刚开始培养时未能观察出来，经过多次细胞传代才会显现出PPV细胞病变。本次PCR检测在细胞培养用试剂中均未检出PPV核酸，且本实验室细胞培养用器皿、操作环境、操作过程均经过严格的消毒控制，所以本实验室IBRS-2细胞感染PPV基本可排除第一种原因，是由上述第二种原因引起的可能性较大。

PPV感染细胞普遍存在，感染的途径复杂多样。例如，李昌文等报道从猪肾细胞系PK15培养物中分离鉴定到一株内源性 PPV（SY-99株）[6]。Croghan等报道，通过实验证明猪睾丸细胞系ST使用被PPV污染的胰蛋白酶消化而感染上PPV[7]。培养细胞尤其是制作疫苗的细胞感染病毒，其后果十分严重。例如，用感染PPV的细胞制作弱毒疫苗去免疫初产母猪，则会造成初产母猪流产、死胎、产木乃伊胎和不孕等繁殖障碍症状[2]，给养猪业造成重大的经济损失。所以在进行病毒培养尤其是PPV增殖培养时，一定要设置未接种PPV的空白细胞对照，以防PPV的非接种感染而出现的假阳性。若空白细胞对照出现PPV感染的细胞病变且PCR检测为PPV阳性，可判断培养用细胞之前已被PPV感染，则同批次的PPV增殖细胞全部都要弃去。

检测PPV病原的方法有多种：病毒分离、电镜观察、血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI）、间接免疫荧光法（IFA）、单克隆抗体技术（McAb）、核酸探针技术（NAP）、银加强胶体金技术（SECGA）、聚合酶链式反应（PCR）等[8]。其中，PCR技术为首选检测方法，因为其它方法存在或耗时长、或操作复杂、或检测成本高等不足。Kary Mullis于上世纪八十年代发明的PCR技术是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法，其具有特异、灵敏、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优点。现在PCR技术广泛应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学和农学等领域，并在此基础上创造了许多DNA体外扩增的新技术[9]。本次检测参考赵俊龙等建立的PCR检测方法，该方法特异性强、灵敏度高，可以检测到10-4个TCID50的PPV含量，其敏感性甚至要优于之前报道的PPV套式PCR方法的敏感性（1个TCID50）[5]。所以应用该PCR检测方法，可以检测出细胞培养试剂中可能污染含量极低的PPV及某些种细胞中可能早期潜伏感染的PPV，这对于避免培养细胞感染PPV具有重要的意义。

[1]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安： 世界图书出版公司，2004：1.

[2]殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京： 科学出版社，1997：1150-1155.

[3]蒋玉雯，郑儒标，黄安国，等.广西猪细小病毒的分离和鉴定[J].广西畜牧兽医，1989（3）：9-12.

[4]蒋玉雯，黄安国，郑儒标，等.猪细小病毒N株的生物学和免疫学特性研究[J].畜牧兽医学报，1992，23（1） ：73-79.

[5]赵俊龙，陈焕春，吕建强，等.猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用[J].中国兽医学报，2003，23（2）：142-144.

[6]李昌文，仇华吉，童光志，等.一株内源性猪细小病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2000，22（9）：90-93.

[7]Croghan DL， Matchett A， Koski TA.Isolation of porcine parvovirus from commercial trypsin[J].Appl Microbiol， 1973，26（3）：431-433.

[8]赵玮，杨俊.猪细小病毒检测方法的研究进展[J].中国猪业，2009，（3）：50-52.

[9]吕学诜.分子诊断学—基础与临床[M].北京： 科学出版社，2008：137.