雌激素及精氨酸对去卵巢大鼠血清一氧化氮水平的影响

景秀菊 祁秀娟 刘建新 汤秀明 刘海宁 赵频

雌激素与心血管疾病的关系已经争论了半个世纪。绝经前女性冠心病(CHD)的发病率仅为男性的1/10至3/10，随着年龄增长，女性CHD发病率增高，55～70岁渐达高峰，以致两性患者CHD发生率的差异趋于缩小。绝经后女性采用雌激素替代疗法，冠脉事件可减少30%～40%。雌激素可能通过影响脂质代谢、糖代谢、血压等方面起到保护心血管的作用，但并不能全面深入地解释其对心血管的保护机制。既往临床试验提示口服一氧化氮(NO)前体L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)对冠心病患者、高脂血症患者、健康老年人、青年吸烟者的内皮功能可以产生影响。口服LArg是否可改善内皮功能，尚存争议。本研究选用2种干预因素雌激素、L-Arg来探讨其对大鼠动脉粥样硬化发生发展的影响。从NO、动脉内皮组织病理变化等角度来探讨不同干预因素的作用，从而为临床探索绝经后安全有效的预防保健措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 3月龄雌性Wistar大鼠40只(购自山东鲁抗医药股份有限公司)，平均体质量为(214.83±10.72)g，分笼饲养，饲养条件符合国家实验动物的饲养标准，实验期间普通饲料饲养，每日光照12 h。随机分为假手术组(A组)、双侧卵巢切除组(B组)、双侧卵巢切除＋苯甲酸雌二醇(E2)治疗组(C组)、双侧卵巢切除＋E2＋L-Arg治疗组(D组)，每组10只。实验前大鼠E2的含量分别为:A组为(38.66 ±3.89)pg/ml、B 组(37.88 ±2.96)pg/ml、C 组(39.39 ± 2.29)pg/ml、D 组(38.89 ± 3.32)pg/ml，各组差异无统计学意义 (P＞0.05)。动物去势:10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.3 ml/kg，于无菌条件下在背部正中切开，进入腹腔在肾下极附近找到卵巢，用4号丝线结扎并摘除双侧卵巢，分层缝合切口。A组仅找到卵巢后即关腹分层缝合切口。术后连续3 d给予青霉素80万U肌注预防感染。术后第3天起连续4 d经阴道做细胞涂片，无角化者证实双侧卵巢切除完全，否则弃去不用。术后1周根据组别给予不同的干预措施，连续4月。动物给药:A组:每3 d肌注，生理盐水0.04 ml;B组:每3 d肌注，生理盐水0.04 ml;C组:E210 μg/d，每 3 d 肌注;D 组:E210 μg/d，每 3 d 肌注，每天2.25%L-Arg饮水。

1.2 标本取材 术后4月，用注射器心脏取血3 ml左右，3000 r/min，15 min，取上层血清，置-20℃冰箱保存备用。剪下胸主动脉约3 cm，立即用10%中性福尔马林固定。

1.3 血清E2、NO、L-Arg浓度的测定 采用北京北方生物技术研究所提供的E2放射免疫分析试剂盒测定各组大鼠血清E2含量;采用南京建成生物工程研究所提供的硝酸还原酶法NO试剂盒检测各组大鼠血清NO含量，按试剂盒操作说明检测。L-Arg采用高效液相色谱法测定(Agilent1100、美国安捷伦公司)［1］。

1.4 主动脉组织切片观察 从10%中性福尔马林液中取出浸泡的胸主动脉，常规石蜡包埋、切片(5 μm厚)，并将切片行HE常规染色，于显微镜下观察内膜厚度。

1.5 统计学处理 数据以均数±标准差表示，多组样本均数的比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。所有统计分析均采用SPSS 18.0统计软件进行处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验期间D组因麻醉意外死亡1只。其余各组存活良好，未见异常反应。

2.1 4月后各组E2、L-Arg、NO水平比较 B组E2和A组比较显著降低，差异有统计学意义，表明大鼠去势成功。C组E2和A组比较差异无统计学意义，表明大鼠去势后适当补充E2后可使体内E2水平增加，并可以接近未去势大鼠的E2水平。D组E2和C组比较差异无统计学意义，表明补充外源性L-Arg对血清E2水平没有影响。

B组L-Arg浓度和A组相比差异无统计学意义，表明去卵巢并不影响血清L-Arg水平。B组L-Arg和C组相比较差异无统计学意义，表明补充雌激素对血清L-Arg水平没有影响。D组L-Arg水平和C组相比显著增加，差异有统计学意义，表明补充外源性L-Arg增加了血清L-Arg水平。

B组NO浓度和A组比较显著降低，差异有统计学意义，提示去卵巢显著降低了大鼠血清NO水平。A组NO和C组比较无统计学差异，说明补充E2后血清NO增加至假手术组水平。D组NO浓度和C组比较显著升高差异有统计学意义，说明补充L-Arg可以显著增加血清NO水平。见表1。

表1 各组E2、L-Arg、NO比较(±s)

表1 各组E2、L-Arg、NO比较(±s)

注:与其他3组比较，*P＜0.05;与C组比较，△P＜0.05

组别 n E2(pg/ml) L-Arg(μmol/L)NO(μmol/L)A组10 42.33±2.77 48.50±2.55 42.87±3.74 B组 10 10.43±2.31* 47.90±3.67 30.19±3.02*C组 10 41.03±3.39 48.00±3.02 40.89±3.07 D组 9 43.50±4.34 92.75±10.09△ 47.05±2.34△

2.2 胸主动脉的形态学观察 3月龄大鼠胸主动脉HE染色后在光镜下观察:A组、C组、D组、胸主动脉壁层次清晰，内膜薄，中层平滑肌层均匀无萎缩，厚度正常，各组之间未见明显差异;B组和以上各组相比，内膜增厚，内皮细胞不完整，未见明显脂质沉积(图1)。

图1 各组大鼠胸主动脉形态学观察(×400)

3 讨论

1980年Furchgott和Zawadski发现了血管内皮依赖性舒张现象，提出了内皮依赖性舒张因子(endothelium derived relaxing factors，EDRF)的概念，1987年Palmer证实NO与EDRF具有相同的化学性质，现已知EDRF即为NO。NO是内皮细胞合成的最重要的血管活性物质，它不但有强大的扩张血管作用，而且有抑制血小板聚集、平滑肌细胞增生、单核细胞黏附和黏附分子表达的作用，从而可防止血管壁发生粥样硬化和血栓形成。

3.1 本实验采用双侧卵巢切除的大鼠模拟绝经模型 卵巢切除后血清E2浓度显著降低，反映了人工绝经后的状态，实验结果显示血清NO与E2水平呈正相关:去势大鼠随着E2水平的下降，血清NO水平明显降低，明显低于未切除卵巢大鼠(A组);去卵巢大鼠接受E2治疗后，血清NO水平升高接近未切除卵巢组，这和以前的众多文献报道结果一致［2-4］。补充E2使血清NO水平升高提示E2可能通过NO途径产生心血管保护效应。另外，发现3月龄A组、C组之间主动脉内膜形态学未见明显差异，而B组和A组比较内膜增厚，内皮细胞不完整。C、D组之间主动脉内膜病变未见明显差异。E2能增加NO合成或释放的机制还不十分清楚。目前大家公认的有:(1)“基因组效应”机制［5］，即经典机制。E2与胞质受体结合，形成激素受体复合物进入细胞核，进而与核内受体结合，转变为激素-核受体复合物，调节基因表达。此种机制发挥作用通常需要数小时。(2)“非基因组效应”机制［6-8］，即快速信号通路:E2通过位于细胞膜上或者毗邻细胞膜的内质网，或者其他相关的雌激素结合蛋白，引起细胞应答反应而发挥效应。此种机制发挥作用只需几秒或几分时间。此外还有雌激素-磷酸肌醇-3激酶-丝氨酸-苏氨酸—内皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路［9］。E2的应用可改善全身及局部症状的作用已被确定［10］，有研究发现，应用E2可降低绝经后妇女的骨转移率［11］。

3.2 药理研究发现 L-Arg是NO的生理性前提，在体内L-Arg和氧分子在NOS催化下生成NO和L-瓜氨酸而发挥生物学效应［12］。最近，L-Arg对血管内皮作用的研究正日益受到科学工作者的广泛关注。人们对L-Arg寄予厚望，以期能以之改善内皮功能，预防及治疗心血管疾病。Boger等［13］对L-Arg-NO途径进行了较多的研究，他们将雄性家兔分为普通喂饲组、高脂喂饲组、高脂喂饲加L-Arg组，喂饲12周，以尿硝酸盐浓度表示体内NO的水平，结果显示L-Arg组尿硝酸盐浓度增加。本实验比较各组血清水平的结果表明:去势或绝经后血清NO低水平存在，提示绝经后提高NO水平的必要性;去卵巢大鼠接受E2治疗后，血清NO水平升高接近未切除卵巢组;补充外源性L-Arg亦可明显提高血清NO水平，此为外源性L-Arg作为体内NO供体的应用提供了实验依据。L-Arg的功效依赖于最初的内皮健康状况。也就是说，基线血流介导的血管舒张越低，L-Arg改善内皮功能的作用越显著。LArg改善内皮功能的作用机制可能与增加NO释放，抑制血小板活化，血栓形成和抑制血管平滑肌细胞增殖有关。

目前许多学者对正常人、高胆固醇患者及动物实验中L-Arg浓度的报道各异。Post等［14］对65名健康的绝经后妇女进行了雌激素替代及安慰剂对照实验，结果发现雌激素治疗组血清精氨酸浓度与对照组相比降低(P=0.05);Verhoeven等［15］对152名健康绝经妇女进行了类似实验，结果提示雌激素治疗组血清精氨酸浓度较对照组显著降低(P＜0.05)，同时以上实验发现雌激素治疗组血清ADMA(内源性NOS抑制剂)显著降低。由于2个实验均未测NO浓度，实验设计者推测雌激素治疗组L-Arg浓度降低是由于雌激素降低了ADMA对NOS的抑制作用，致使L-Arg生成NO消耗增多所致。Xiong等［16］比较了6月龄及20月龄雄性SD大鼠的血清L-Arg浓度结果差异无统计学意义。本实验A、B、C组间L-Arg浓度未发现明显差异，L-Arg浓度是否存在统计学差异尚需进一步大样本实验研究。

L-Arg是生成NO的前体，L-Arg来源不足、转运障碍或代谢异常都可影响NO的生成，应该指出的是，在体内L-Arg易被肝脏摄取而进入鸟氨酸循环。因此，合成可选择性地易被内皮细胞摄取的、高效和长效的L-Arg衍生物，将有助于L-Arg在心血管疾病治疗中的广泛、有效的应用。

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