微波协同酶法提取金针菇多糖工艺的优化

黄 琼 丁 玲

（福建农业职业技术学院，福建 福州 350007）

金针菇（Flammulina velutipes）担子菌目金钱菌属，富含蛋白质、碳水化合物、矿物质、维生素和粗纤维，含脂肪较低，具有很好的药用价值［1］。金针菇多糖 （Flammulina velutipes polysaccharides，FVP）是金针菇的主要活性成分之一，具有增强记忆力、抗疲劳；抗肿瘤，提高机体免疫力；抗衰老，抗有害药物对机体损害的作用［2］。

微波提取法因其具有高效性，操作简便，得率高，产物易于纯化等特点已广泛应用于天然产物的提取［3－5］，而酶作用于金针菇真菌细胞，使金针菇真菌细胞壁破裂，促进多糖的溶出，提高了多糖的得率。多糖的提取，目前主要有水提醇析法、微波法、超声波法等［6，7］，但微波协同酶法提取金针菇多糖工艺鲜见报道，近年研究［8－10］表明微波协同酶法可显著提高多糖的提取率。因此，本试验采用微波协同酶法提取金针菇多糖，旨在为金针菇多糖的进一步纯化和活性研究奠定基础，同时也为金针菇保健食品的开发提供一条新的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料

金针菇子实体干粉：福建农业职业技术学院食用菌基地提供新鲜金针菇，自然晒干1d，60℃烘干至恒重，机械粉碎后过60目筛得。

1.1.2 试剂

果胶酶、纤维素酶：酶活力≥105U／g，西安沃尔森生物技术有限公司；

葡萄糖、苯酚、浓硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器设备

紫外可见分光光度计：TU－1221型，北京普析通用仪器公司；

精密pH计：PHSJ－3F型，上海精密科学仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE－52A型，上海天呈科技有限公司；

高速冷冻离心机：LGR10－4.2型，上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 酶解法单因素试验设计方案

（1）果胶酶浓度的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水提取，设果胶酶浓度分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5% （m∶m），酶解温度为40℃，酶解时间为1.0h，pH值为4.0。提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察果胶酶浓度对金针菇多糖得率的影响。

（2）pH值的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水提取，设果胶酶浓度为0.4% （m∶m），pH 值分别为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，酶解温度为40℃，酶解时间为1.0h。提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察pH值对金针菇多糖得率的影响。

（3）酶解温度的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水提取，设果胶酶浓度为0.4% （m∶m），pH 值为4.0，酶解温度分别为35，40，45，50，55℃，酶解时间为1.0h。提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察酶解温度对金针菇多糖得率的影响。

（4）酶解时间的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水提取，设果胶酶浓度为0.4% （m∶m），pH值为4.0，酶解温度为45℃，酶解时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5h。提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察酶解时间对金针菇多糖得率的影响。

1.2.2 微波协同酶法单因素试验设计方案

（1）微波功率对金针菇多糖得率的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水，按酶解最佳工艺条件进行提取，后微波提取，设微波功率分别为150，300，450，600，750W，料液比为1∶20（m∶V），提取时间为60s的条件下提取1次，提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察微波功率对金针菇多糖得率的影响。

（2）料液比对金针菇多糖得率的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水，按酶解最佳工艺条件进行提取，后微波提取，设微波功率为600W，分别设料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（m∶V），提取时间为60s的条件下提取1次，提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察料液比对金针菇多糖得率的影响。

（3）提取时间对金针菇多糖得率的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水，按酶解最佳工艺条件进行提取，后微波提取，设微波功率为600W，料液比为1∶20（m∶V），分别设提取时间为45，60，75，90，105，120s的条件下提取1次，提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。以多糖得率为指标，考察提取时间对金针菇多糖得率的影响。

（4）提取次数对金针菇多糖得率的影响：精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水，按酶解最佳工艺条件进行提取，后微波提取，设微波功率为600W，料液比为1∶20（m∶V），提取时间为90s的条件下，分别微波提取1，2，3，4次，以多糖得率为指标，考察提取次数对金针菇多糖得率的影响。

1.2.3 金针菇多糖得率 参照文献［10］按式（1）计算多糖得率：

1.3 数据处理

采用DPS数据处理软件对试验数据进行分析与处理。

2 结果与分析

2.1 酶解条件的优化

2.1.1 不同酶对金针菇多糖得率的影响 精确称取金针菇子实体干粉放入烧杯中，加入3倍质量体积的蒸馏水进行提取，设定酶解温度为40℃，分别加入0.20%（m∶m）的纤维素酶、0.20% （m∶m）的果胶酶、0.10% （m∶m）的纤维素酶和0.10%（m∶m）果胶酶的复合酶，调节溶液pH为4.5，酶解1.0h。提取液经离心、真空浓缩、4倍80%乙醇沉淀、真空抽滤、恒温干燥得金针菇粗多糖。并与不加酶作对比，以多糖得率为指标，考察不同酶对金针菇多糖得率的影响，所有试验均重复3次，数据取平均值，结果见图1。

图1 不同酶的加入量对金针菇多糖得率的影响Figure 1 Effect of the different enzyme concentration on the yield of polysaccharide

由图1可知，采用酶法提取，金针菇多糖得率显著提高。其中用0.20%（m∶m）的果胶酶提取，金针菇多糖得率最高。其原因是果胶酶能破坏组织间质中的胞间连结构，有效地促使各种化学物质从植物组织中释放出来，从而减少沉淀增加多糖得率。因此，选定果胶酶来提取金针菇多糖。

2.1.2 酶解最佳工艺条件的确定 在单因素试验基础上进行正交试验，优化提取工艺。选择对多糖得率影响较大的4个因素（果胶酶浓度、pH值、酶解温度和酶解时间）设计L9（34）正交试验，所有试验均重复3次，数据取平均值，正交试验因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 酶解正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results of extraction

由表2可知，对金针菇多糖得率影响的主次顺序依次为果胶酶浓度（A）＞酶解温度（C）＞pH值（B）＞酶解时间（D）。最优因素水平组合为A3B2C2D2，即酶解温度45℃，酶解时间1.5h，调节溶液pH 4.0，加入0.40% （m∶m）果胶酶为酶解最佳工艺条件。

2.1.3 验证实验 由表2可知，最佳方案为A3B2C2D2，而正交表中没有该组合方案，为了进一步考察酶解提取工艺条件的准确性，按照最优组合A3B2C2D2进行3次重复实验，取平均值，在最佳条件下金针菇多糖得率为17.26%。

2.2 微波协同酶法最佳工艺条件的确定

在单因素试验基础上，对微波功率、料液比、提取时间和提取次数4个因素进行正交试验，以确定最佳提取工艺参数，并考察各因素对金针菇多糖得率影响的主次顺序。所有试验均重复3次，数据取平均值，正交试验因素水平见表3，结果见表4。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test

表4 微波提取正交试验结果与分析Table 4 Orthogonal test results of extraction

由表4可知，对多糖得率影响因素大小依次为微波功率（A）＞料液比（C）＞ 提取次数（D）＞提取时间（B）。试验结果较好的方案为A3B2C1D3，且表中试验号为8的试验结果即金针菇多糖得率最高，也验证了此因素水平组合为最佳提取工艺条件。因此，微波协同酶法提取金针菇多糖的最佳工艺组合为酶解温度45℃，加入0.40%（m∶m）果胶酶，调节溶液pH为4.0，酶解时间1.5h，微波功率600W，料液比1∶20（m∶V），提取时间90s，提取3次。在最佳条件下，金针菇多糖得率为21.76%。

3 结论

（1）采用微波协同酶法新技术提取金针菇多糖明显优于传统提取法。一方面，微波加热具有高效性，能深入渗透细胞，快速升高温度，使其溶解出更多的金针菇多糖提高其得率，且显著缩短提取时间，有利于工业化生产。另一方面，果胶酶破坏组织间质中的胞间连结构，多糖易从细胞内释放出来，提高了多糖得率。因此，应用微波协同酶法提取工艺较大程度地提高金针菇多糖得率。

（2）微波协同酶法提取金针菇多糖的最佳提取工艺条件为酶解温度45℃，加入0.40%（m∶m）果胶酶，溶液pH 4.0，酶解时间1.5h，微波功率为600W，料液比1∶20（m∶V），提取时间90s，提取3次，在最佳条件下，微波协同酶法的得率为21.76%，与单一的微波法（7.81%）相比，提高了13.95%。与酶解法（17.26%）相比，提高了4.50%。

1 Leung M Y K，Fung K P，Choy Y M.The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti－tumor polysaccharide preparation fromFlammulina velutipes［J］.Immun Pharmacology，1997，35（3）：255～263.

2 王大红，刘明华.金针菇多糖提取条件的优化［J］.武汉职业技术学院学报，2009（5）：76～80.

3 黄琼，陈婵，彭宏，等.微波法萃取紫色甘薯皮原花青素工艺的研究［J］.食品科技，2010，35（4）：199～203.

4 文春娟，陈祥贵，饶凤，等.微波辅助提取石榴皮多酚工艺研究［J］.食品与机械，2011，27（6）：103～106.

5 刘晓丽，钟少枢，于泓鹏，等.微波法和水蒸馏法提取丁香精油的研究［J］.食品与机械，2012，28（4）：110～112.

6 李世敏，刘冬.金针菇多糖提取新工艺的优化［J］.食品与发酵工业，2002，28（10）：45～48.

7 李志洲，杨海涛，闵镇田.金针菇多糖最佳提取工艺研究［J］.宝鸡文理学院学报（自然科学版），2003，23（1）：39～41.

8 赵玉，徐雅琴.微波协同酶法提取南瓜多糖最佳提取条件的研究［J］.食品工业科技，2009，30（1）：221～223.

9 陈红，张艳荣，王大为.微波协同酶法提取玉米须多糖工艺的优化研究［J］.食品科学，2010，31（10）：41～44.

10 朱彩平，肖智敏.微波协同酶法提取平菇柄多糖的工艺研究［J］.天然产物研究与开发，2011，23（1）：118～122.