绿茶多酚的最适冲泡溶出条件及成分分析

陈正函，吕晓玲，*，徐蕾然，孟 颖，张 锋

(1.天津科技大学，天津300457;2.葫芦岛茂华生物有限责任公司，辽宁葫芦岛125203)

茶起源于中国，是我国的国饮，并且享誉中外。古人有称之为“南方之嘉木”;《桐君录》中记载，“西阳、武昌、晋陵皆出好茗”;欧阳修也有“建安三千里，京师三月尝新茶”的词句［1］。起初，茶用于药用、食用，后来开始饮用，并且伴随茶文化的发展，形成了一个泡茶与饮茶的艺术——茶艺。但生活质量逐渐提高的同时，忙碌之余，倒一些热水，喝茶更多的是为了补充水分，增加口感，而像茶艺那样的品茗就相对少了一些。茶多酚由茶叶中的黄烷醇类(儿茶素类)、花青素类、黄酮、黄酮醇类等30多种多酚类物质组成，是对人体有益的活性成分，能够消除自由基、络合金属离子，具有抗氧化活性，增强机体免疫力［2-5］。目前关于茶多酚的研究多集中于其性质［6］、含量测定［7］及如何提高提取率［8］，而冲泡条件的研究也仅局限于时间、温度等主要因素，忽略了冲泡容器、习惯等因素对溶出量的影响。本文从生活角度出发，系统全面的对泡茶的主要因素、个人生活习惯因素进行研究，使泡茶过程中茶多酚溶出量得到提高。以绿茶为研究对象，采用单因素和响应面分析方法，得出合适的冲泡条件，并通过高效液相色谱法［9］进一步探讨最适条件冲泡中儿茶素类和咖啡碱的溶出量对滋味的影响，为科学研究及科学饮茶提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

绿茶(江苏洞庭碧螺春)购于市场，2011年3月产;无水碳酸钠、没食子酸 均为分析纯;福林酚试剂 天津博美科生物技术有限公司;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、儿茶素(C)、咖啡碱(caffeine)标准品 上海顺勃生物工程有限公司。

UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;LC-20A型高效液相色谱系统日本岛津公司。

1.2 试样冲泡与茶多酚的测定方法

模拟生活泡茶，以绿茶为样品，在不同的温度、液料比、时间、次数、冲泡容器、是否加盖和搅拌条件下进行实验，分析不同因素对茶汤中茶多酚溶出量的影响，采用GB/T 8313-2008［10］福林酚法对茶汤中多酚的溶出量进行计算。

1.2.1 冲泡温度对茶多酚溶出量的影响 称取1.0g的绿茶，分别加入 100mL 60、70、80、90、100℃的蒸馏水，冲泡5min，不搅拌，冲泡一次，过滤，用少许蒸馏水清洗滤渣，合并滤液，定容至100mL，测定茶汤中茶多酚溶出量。

1.2.2 液料比对茶多酚溶出量的影响 称取1.0g绿茶，分别以液料比为 50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1(mL/g)加入80℃蒸馏水冲泡5min，测定茶多酚溶出量。

1.2.3 冲泡时间对茶多酚溶出量的影响 称取1.0g绿茶，加入150mL 80℃的蒸馏水分别冲泡2、5、8、11、14min，测定茶多酚溶出量。

1.2.4 冲泡次数对茶多酚溶出量的影响 称取1.0g绿茶，加入150mL 80℃的蒸馏水冲泡5min，过滤后的滤渣继续进行第二次、第三次冲泡，测定茶多酚溶出量。

1.2.5 生活习惯因素对茶多酚溶出量的影响 称取1.0g绿茶分别置于同内径的保温杯和玻璃杯中，加入150mL 80℃的蒸馏水冲泡5min，另采用保温杯进行加盖与无盖处理以及在无盖条件下进行搅拌和不搅拌处理的实验，测定茶多酚溶出量。

1.3 响应面分析实验优化茶多酚提取工艺

采用Design Expert 7.0，根据Box-Behnken设计原理，在单因素实验的基础上，选取温度、液料比和时间三个因素，以茶多酚溶出量为响应值，采用三因素三水平响应面分析方法对茶多酚提取工艺进行优化，响应面实验因素与水平见表1。

表1 实验因素水平及编码表Table 1 Codes and levels of factors chosen for test

1.4 儿茶素类及咖啡碱的测定方法

1.4.1 色谱条件 采用Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相A:3%甲酸水溶液，流动相 B:甲醇。梯度洗脱程序为(min/B%):0/2、20/32、30/40。检测波长 278nm，流速 1.0mL/min，柱温 35℃，进样量20μL。

1.4.2 标准曲线 分别精密称取8种标准品10mg置于10mL的容量瓶中，定容即得浓度为1mg/mL的标准储备溶液，分别吸取一定量的上述标准储备液配成系列标准溶液，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。为方便与样品图进行分析，配制浓度分别为咖啡碱 100μg/mL、EGCG 50μg/mL、EGC 200μg/mL、ECG100μg/mL、GCG100μg/mL、EC 100μg/mL、C 50μg/mL 和 GC 200μg/mL的混合标准溶液，按1.4.1条件进样得到混合标准品液相图。

1.4.3 样品溶液的制备 以响应面分析实验得到的绿茶茶多酚最适冲泡条件进行冲泡，茶汤过0.22μm水相滤膜，进样测定峰面积，根据各成分标准曲线得出浓度并算出溶出量。

1.5 数据统计

实验结果以平均值±标准差(¯X±SD)表示，每个处理重复3次，显著性分析采用SPSS17.0分析软件进行。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 温度对茶多酚溶出量的影响 由图1可知，60～80℃茶多酚溶出量随着温度的升高而增加明显，随后增加变缓，80～100℃间差异不显著(p＞0.05)。因绿茶采用嫩叶加工制成，水温过低，溶出量较少，水温过高，汤色易变黄，茶叶表面易熟化、结膜，阻碍茶多酚等成分的溶出，且维生素C等有益成分易遭破坏，综合考虑，选取80℃为最适温度。

图1 温度对绿茶茶多酚溶出量的影响Fig.1 Effect of temperature on the polyphenol contents of green tea infusion

2.1.2 液料比对茶多酚溶出量的影响 由图2可知，50～150mL/g时随着液料比的增加，茶多酚溶出量增大，150∶1(mL/g)时达 113.87mg/g，随后呈轻微下降趋势，在相同的温度和时间里，水量越大，降温速度越慢，茶多酚会部分发生氧化，并且伴随茶汤中溶出物含量增多，溶剂比例增加，对溶出物起到一定的稀释作用，影响口感，故选择150∶1(mL/g)为最适液料比。

2.1.3 时间对茶多酚溶出量的影响 由图3可知，绿茶的茶多酚溶出量随着时间的增加，呈现先增后减的趋势，且在5min达到最大值，一般茶的滋味随着冲泡时间延长而逐渐增浓，茶多酚溶出量逐渐增大，但时间过长，会造成部分茶多酚氧化，选择5min为最适时间。

2.1.4 次数对茶多酚溶出量的影响 不同冲泡次数对茶多酚溶出量的影响见图4。第一次冲泡可使大部分茶多酚溶出，第二次后溶出量明显减少，而随着次数的增加，较易溶出的氨基酸、维生素C和可溶性糖等成分的溶出量减少，口感明显变差，因此确定冲泡次数为1次。

表2 生活习惯因素对茶多酚溶出量的影响Table 2 Effect of habit factors on the polyphenol contents in tea infusions

图2 液料比对绿茶茶多酚溶出量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratioon the polyphenol contents of green tea infusion

图3 时间对绿茶茶多酚溶出量的影响Fig.3 Effect of time on the polyphenol contents of green tea infusion

图4 次数对绿茶茶多酚溶出量的影响Fig.4 Effect of brewing times on the polyphenol contents of green tea infusion

2.1.5 生活习惯因素对茶多酚溶出量的影响 采用绿茶对生活习惯因素(冲泡容器、是否加盖、是否搅拌)冲泡下茶多酚的溶出量进行研究，其中冲泡容器选择玻璃杯和保温杯，结果见表2。保温杯起到恒温作用，多酚较易溶出，可见泡茶所用器具对茶多酚的溶出量存在一定的影响，但是作用不大，影响不显著(p＞0.05)。搅拌可使茶叶充分浸泡，多酚的溶出量大幅度提高，但伴随着其他成分的大幅度溶出，会一定程度的影响口感，可根据个人喜好决定搅拌时间。对于绿茶，不加盖溶出量略高，可根据实际情况而定。

2.2 响应面实验设计

2.2.1 响应面实验结果及方差分析 在单因素实验的基础上，根据响应面实验设计，以温度、液料比、时间3个因素为自变量，茶多酚溶出量为响应值，实验结果见表3。

表3 响应面分析实验结果Table 3 Results of response surface analysis experiment

经二次多项回归拟合，得到各实验因子对响应面影响的回归方程为:茶多酚溶出量(mg/g)=116.35+8.05A+1.26B+12.72C-2.72AB-3.55AC-0.33BC-19.60A2-8.58B2-9.02C2。

对模型方程进行方差分析表明，该方程显著，结果见表4。其中校正决定系数=0.9622，相关系数R2=0.9834，说明回归方程对实验拟合度较好，失拟项不显著，各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，使响应值变化复杂，所以二次相应曲面回归方程能够很好的拟合本实验所得的结果。

2.2.2 响应面曲面分析 响应面图形是响应值对各因素(A、B、C)所构成三维空间的曲面图，根据回归方程作出不同因子的响应面分析图，结果见图5。响应面图代表着在第三个变量保持最佳水平时，另两个独立变量之间的交互作用。

由响应面实验得绿茶茶多酚最适冲泡条件为:温度 81.42℃、液料比 151.92∶1(mL/g)、时间7.03min，茶多酚溶出量理论最大值为121.23mg/g，为了实际操作方便，修正条件为温度81℃、液料比150∶1(mL/g)、时间7min，采用修改后最适条件进行验证实验，结果为茶多酚溶出量为(112.80±0.10)mg/g，相对标准偏差RSD为0.88%。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for second-order polynomial model fitted to the response variable

图5 响应面分析图Fig.5 Response surface graphs

2.3 高效液相色谱分析结果

在以茶多酚为响应值得出的最适条件下进行冲泡，采用高效液相色谱法，以总酚研究为基础，对茶汤中儿茶素类及咖啡碱溶出量进行分析，进一步探讨最适冲泡条件下各成分溶出量之间相互作用对茶滋味的影响。各成分标准曲线和线性范围见表5，其中保留时间与混合标准品色谱图相对应。混合标准品色谱图(A)及绿茶最适冲泡条件下样品色谱图(B)见图6。由图6可知，样品与标准品图中所对应峰的信息一致，虽绿茶成分复杂，但所研究成分在30min内均得到分离，可以进行HPLC定量分析。

图6 混合标准品色谱图和样品色谱图Fig.6 Chromatograms of standard solution and sample solution

根据标准曲线回归方程与峰面积可计算出各成分的溶出量，结果见表6。在响应面最适条件下冲泡，总儿茶素溶出量占茶多酚溶出量的57.29%，是多酚类物质的主体部分，赋予了绿茶特有的涩味。其中EGCG、ECG、EGC和EC的溶出量较高，GCG未检出，C和GC的溶出量较少。除总酚外，咖啡碱溶出量也较高，使绿茶略带苦味，因绿茶属不发酵茶，咖啡碱的含量相比较其他发酵茶略低些，但最适条件冲泡仍得到较高的溶出量，与儿茶素类共同作用，对改善茶汤的滋味起到一定的作用，减轻单一存在的苦味和涩味，使茶味醇和。

表5 标准曲线线性方程Table 5 Linear equation of the standard

表6 绿茶茶汤儿茶素类和咖啡碱Table 6 Catechins and caffeine of green tea infusion

3 结论

本实验模拟生活泡茶，以绿茶为样品，研究了温度、液料比、时间、次数以及生活习惯因素对茶多酚溶出量的影响。通过单因素实验和响应面分析实验得出绿茶茶多酚的最适冲泡溶出条件:1g绿茶加150mL水在 81℃下冲泡 7min，茶多酚溶出量为112.80mg/g。生活中小小的变化可以使溶出量大幅度提高，为避免口感过于单薄或浓重，在可接受范围内可适当搅拌，不同的容器和是否加盖可根据个人生活习惯以及口感需求进行调整。在最适条件下冲泡，采用液相对儿茶素类和咖啡碱进行测定，发现EGCG、ECG、EGC、EC 和咖啡碱有较高的溶出量，对改善绿茶的滋味起着重要的作用。

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