多贝斯干预前后TSP-1在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达

江雪丰 周希瑗

多贝斯干预前后TSP-1在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达

江雪丰 周希瑗

目的 检测TSP-1在早期糖尿病大鼠视网膜组织中的表达并探讨其作用。方法 采用链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病模型, 成模后随机分成两组,糖尿病组和多贝斯组,其中, 多贝斯治疗组在出现糖尿病表现后按100 mg/kg/d, 糖尿病组和正常对照组只在同期灌胃等量生理盐水。注射后1、3个月采用免疫组织化学方法检测视网膜中TSP-1阳性反应及其分布。结果 各组糖尿病大鼠视网膜TSP-1蛋白质阳性着色的积分光密度值均较正常组降低(P＜0.05)。结论 TSP-1蛋白质在糖尿病大鼠视网膜中的表达明显降低并与病程有关, 提示TSP-1表达不足可能是糖尿病视网膜病变的原因之一。

糖尿病视网膜病变；免疫组织化学；血小板反应蛋白-1, 多贝斯

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病严重的微血管并发症, 是不可逆性失明的重要原因［1］,其发病机理比较复杂, 受多种血管刺激因子和抑制因子调控。血小板反应蛋白-1(thrombospondin-l, TSP-1)已被公认为一种有效的内源性血管生成抑制因子。作者通过研究TSP-1蛋白在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达, 探讨其可能在DR中意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型建立 实验用封闭群雄性Wistar大鼠60只, 体质量180~280 g, 标准条件饲养, 不限饮食。实验前禁食12h, 自由饮水。将链脲佐菌素(streptozotocin, STZ;Sigma公司)按65 mg/kg一次性腹腔内注射, 注射后24~48h检测血糖浓度达16.65 mmol/L, 尿糖达+++-~++++为模型建立成功。成模后随机分为糖尿病组(10只x 2)、多贝斯治疗组(10只x 2), 另取20只正常大鼠作为正常对照组。多贝斯治疗组在出现糖尿病表现后按100 mg(kg·d)灌胃, 糖尿病组和正常对照组灌胃等量生理盐水。

1.2 眼球标本的取材和制片 分别于1月、3月将各组大鼠以体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉。摘除眼球, 固定,冲洗、脱水、透明, 浸蜡, 包埋, 备用。连续6μm切片用于免疫组化。

1.3 各组大鼠视网膜TSP-1检测 采用免疫组织化学SP法, 主要操作步骤为：切片脱蜡、水化； 3%H2O2灭内源性过氧化物酶活性；微波修复抗原, 封闭非特异性抗原；滴加TSP-1一抗(稀释度为1：100), 4℃过夜； 滴加生物素化二抗及辣根酶标记链霉素卵白素工作液, DAB显色, 苏木精复染,常规梯度乙醇脱水, 透明, 胶封、镜检。

1.4 图像采集分析 采用Image-Pro Plus 图像分析系统测定视网膜TSP-1的积分光密度进行数据分析。

1.5 统计学处理 采用SAS 10.0统计学软件进行单因素方差分析, 以(P＜0.05)为差异有统计学意义。

2 结果

各组TSP-1免疫组织化学染色结果

光镜观察1个月时, 正常对照组中TSP-1蛋白质的阳性反应表达分布于视网膜的内界膜、内丛状层、内核层、外丛状层, 呈深棕黄色；TSP-1蛋白质在糖尿病组大鼠视网膜的表达空间范围同正常组,呈棕黄色, 与正常组比较明显下降, 内丛状层、内核层降低尤为明显,P＜0.05差异有统计学意义, 多贝斯干预组大鼠视网膜TSP-1蛋白质的阳性表达也降低, 基本同糖尿病组；3个月时, 糖尿病大鼠视网膜TSP-1蛋白质的阳性表达较正常对照组显著降低, 尤其在内丛状层、外丛状层呈极微弱的阳性表达, 而多贝斯干预组大鼠视网膜TSP-1蛋白质的阳性表达呈中等程度, 阳性反应程度及表达区域较同时期糖尿病组显著增加(见表1)。

表1 各组大鼠视网膜中TSP-1平均积分光密度值的图像分析结果s)

表1 各组大鼠视网膜中TSP-1平均积分光密度值的图像分析结果s)

注：a表 示和糖尿病组比较P＜0.05

组别1个月3个月正常对照组26.34±3.40a25.91±3.31a糖尿病组21.5±3.0215.93±2.41多贝斯组22.43±3.5923.23±3.16*

3 讨论

DR是糖尿病微血管并发症之一, 基本病理过程表现为微循环障碍, 主要病理改变为视网膜血管渗透性增加, 新生血管形成, 最终导致视功能不可逆性损害［2］。TSP-l已被公认为一种有效的内源性血管生成抑制因子, 在体外可直接抑制兔黄体、牛肾上腺皮质、肺动脉以及人脐静脉的内皮细胞增殖, 这种抑制作用可被抗TSP-1的单克隆抗体所中和［3-5］。有研究表明, 在氧诱导的缺血性视网膜病变过程中TSP-1的表达增加可使视网膜前新生血管减弱［3］。有报道发现TSP-1在视网膜周细胞的增殖扩散和迁移中起了重要作用并影响视网膜血管的发育和动态平衡［6］。TSP-1的抗血管新生作用受到众多学者关注。

本试验表明, TSP-1免疫阳性反应在正常大鼠视网膜中表达较强, 主要表达于内界膜、内丛状层、内核层、外丛状层 。而在 STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中, TSP-1蛋白质的阳性表达比正常大大减弱, 并随病程的延长有逐渐减少的趋势, 表达的空间范围亦有所缩小, 药物组中TSP-1的表达升高。考虑多贝斯是临床疗效确切的DR微血管保护剂, 可有效改善视网膜微循环, 促进DR病情的稳定或改善。上述免疫组化结果表明TSP-1在眼部血管自身稳定中起一定的重要作用以及它的降低与早期糖尿病相关的血管异常有关,其作用机制有待进一步研究。

［1］ Studholme S. Diabetic retinopathy . J Perioper Pract, 2008,18(5):205 -210.

［2］ Armulik A,Abramssion A,Betsholtz C.Endothlial/pericyte interaction. Circ Res,2005,97(6):512-523.

［3］ Wu Z,Wang S, Sorenson CM, et al.Attenuation of retinal vascular development and neovascularization in transgenic mice over—expressing thrombospondin-I in thelens.Dev Den, 2006, 235(7):1908-1920.

［4］ Uno K, Bhutto IA, McLeod DS, et a, .Impaired expression of thwmbospondin-1 in eyes with age related macular degeneration.BrJ 0phthalmol,2006, 90(1):48-54.

［5］ Ng TF, Turpie B, Masli S. Thrombospondin-1-mediated regulation of microglia activation after retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009 Nov, 50(11):5472-5478.

［6］ Scheef EA, Sorenson CM, Sheibani N. Attenuation of proliferation and migration of retinal pericytes in the absence of thrombospondin-1. Am J Physiol Cell Physiol, 2009 Apr, 296(4): C724-734.

330009 江西省南昌市第三医院眼科(江雪丰)； 重庆医科大学附属第二医院眼科(周希瑗)

江雪丰 Email：jxfeng2005@126.com