HPLC法同时测定双氯达克乳膏中2种主药及防腐剂的含量

陈红君，干志彬，沈鸣，袁杰，余自成#（.同济大学附属杨浦医院/上海市杨浦区中心医院临床药学与药理学研究室，上海 0009；.上海市肿瘤研究所，上海 0003）

双氯达克乳膏为我院自制制剂，由氯霉素、丙酸氯倍他索等与乳膏基质混匀制成，临床上用于治疗神经性皮炎、银屑病、湿疹和各种瘙痒等，疗效确切。制剂中所用的羟苯乙酯为尼泊金酯类化合物，是一类很有效的防腐剂，普遍应用于医院制剂的软膏和液体制剂处方中。近年来国外研究显示其在临床上有多种不良反应，尤以过敏反应多见[1-2]。医院外用乳膏剂中其常用量为0.1%[3]，有报道[4]建议羟苯乙酯用量可控制在0.03%～0.06%，以降低其不良反应发生几率。因此医药学工作者应控制这类防腐剂的处方含量在适宜水平，不宜高于目前的常用含量。为此，笔者建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定双氯达克乳膏中氯霉素、丙酸氯倍他索及羟苯乙酯的含量，以控制制剂质量，研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器

HPLC系统，包括1525二元泵、2489紫外检测器、2707自动进样器、智能柱温箱、BreezeTMSoftware色谱工作站（美国Waters公司）；MS204S型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

氯霉素对照品（批号：130303-200614，纯度：99.3%）、丙酸氯倍他索对照品（批号：100302-200602，纯度：99.8%）、醋酸氟轻松对照品（内标，批号：100010-201108，纯度：99.6%，使用前105℃干燥2h）均来源于中国食品药品检定研究院；羟苯乙酯对照品（广东省台山市新宁制药厂，批号：20100701，纯度：100.1%）；双氯达克乳膏（批号：2012001、2012002、2012003，规格：每盒20g，含氯霉素0.2g、丙酸氯倍他索0.01g、羟苯乙酯0.02g）及不含主成分的空白基质均由我院制剂室制备；试验用水均为超纯水，甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯。

2 方法与结果[5-6]

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品混合溶液的制备。精密称取对照品氯霉素250.0mg、丙酸氯倍他索50.0mg、内标7.5mg、羟苯乙酯25.0mg，分别置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为10.0、2.0、0.3、1.0mg/ml的对照品贮备液。分别精密量取除内标贮备液外的对照品贮备液适量，置于25ml量瓶中，再加入内标贮备液1.25ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即制成含氯霉素0.4mg/ml、丙酸氯倍他索0.02mg/ml、羟苯乙酯0.04mg/ml，并含内标0.015mg/ml的对照品混合溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备。精密称取双氯达克乳膏1g（约含氯霉素10mg、丙酸氯倍他索0.5mg、羟苯乙酯1mg），置于25ml量瓶中，精密加内标溶液1.25ml，加甲醇约20ml，于70℃水浴中加热10min，小心摇荡使主药尽量溶解；放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，置于冰浴中冷却2h以上，取出后用0.45μm微孔滤膜迅速滤过，续滤液放冷，即得供试品溶液。空白基质由不含3个被测组分的其他组分按处方比例制得，同法处理得空白基质试液。

2.2 检测波长的选择

取丙酸氯倍他索（0.02mg/ml）、氯霉素（0.02mg/ml）、羟苯乙酯（0.008mg/ml）3溶液进行扫描，光谱图见图1。

图1 3组分的紫外吸收光谱图Fig 1 UV spectrums of 3components

由图1可见，丙酸氯倍他索、羟苯乙酯及氯霉素的最大吸收波长分别为240、256、277nm，同质量浓度丙酸氯倍他索与氯霉素的最大吸收强度相当，0.008mg/ml的羟苯乙酯的最大吸收强度比其他2种组分的最大吸收强度高，加之样品中3种组分含量之比为氯霉素-羟苯乙酯-丙酸氯倍他索＝20∶2∶1，鉴于丙酸氯倍他索量最低，最大吸收较弱，此组分测定波长选择240nm为佳。笔者曾试验0～6min使用270nm、6～14min使用240nm的双波长检测，但由于波长差距较大，转化后基线漂移较大，导致内标峰形不好，丙酸氯倍他索含量测定准确度不理想；且双波长检测对仪器要求较高，影响方法的适用性。最终本文选定240nm为3种组分共同检测的波长。

2.3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：XBrigeTMC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾-甲醇（35∶65），流速：1.0ml/min；紫外检测波长：240nm；进样量：20μl；柱温：40℃；灵敏度：0.002AUFS。取“2.1”项下对照品混合溶液、供试品溶液和空白基质试液进样分析。结果在该色谱条件下，氯霉素、羟苯乙酯、内标及丙酸氯倍他索的色谱峰形良好，保留时间分别为3.46、4.44、9.63、13.35min，4种组分的理论板数均大于2800，分离度均大于3.7，基质不干扰主成分的测定，色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图A.空白基质试液；B.对照品混合溶液；C.供试品溶液；1.氯霉素；2.羟苯乙酯；3.内标；4.丙酸氯倍他索Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank matrix solution；B.mixed solution of substance control；C.test sample solution；1.chloramphenicol；2.ethylparaben；3.internal standard；4.clobetasol propionate

2.4 标准曲线的制备

分别精密量取除内标溶液外的对照品贮备液适量，置于25ml量瓶中，再各加入内标贮备液1.25ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成一系列不同质量浓度的标准溶液（氯霉素为0.11、0.22、0.56、1.11、2.22mg/ml，丙酸氯倍他索为 0.005、0.01、0.028、0.056、0.11mg/ml，羟苯乙酯为 0.01、0.02、0.056、0.11、0.22mg/ml），进样测定。氯霉素与羟苯乙酯分别按外标法以色谱峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，丙酸氯倍他索按内标法以丙酸氯倍他索与内标峰面积之比（y）对质量浓度（x）进行线性回归，结果见表1。

2.5 精密度试验

表1 3种组分的线性关系（n＝5）Tab 1Linear ranges of 3components（n＝5）

取对照品混合溶液适量，分别在同日内重复进样5次，测定其峰面积；另连续测定5d，每日进样1次。结果，氯霉素、丙酸氯倍他索、内标、羟苯乙酯的日内RSD分别为0.63%、0.97%、0.83%、0.87%（n＝5），日间 RSD 分别为 1.09%、1.26%、0.89%、0.95%（n＝5）。

2.6 回收率试验

取空白基质1g，精密称定，共9份，按处方比例精密加入低、中、高不同量的氯霉素、丙酸氯倍他索和羟苯乙酯对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。以标准曲线定量各被测组分，回收率试验结果见表2。

表2 回收率试验结果（n＝9）Tab 2Results of recovery tests（n＝9）

2.7 样品含量测定

精密称取双氯达克乳膏1g（约含氯霉素10mg，丙酸氯倍他索0.5mg，羟苯乙酯1mg）置于25ml量瓶中，精密加内标溶液1.25ml，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。氯霉素和羟苯乙酯按外标法以峰面积计算含量，丙酸氯倍他索以内标法计算含量。样品中3组分含量测定结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝4）Tab 3Results of content determination of samples（n＝4）

2.8 稳定性试验

取供试品溶液适量，按“2.3”项下色谱条件，分别于第0、1、2、4、6、8、12h进样测定，计算。结果，供试品中氯霉素、丙酸氯倍他索及羟苯乙酯的RSD分别为0.59%、0.87%及0.89%，表明供试品溶液在12h内稳定。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

本试验曾测试了色谱柱XBrigeTMC18（250mm×4.6mm，5μm）与Symmetry®C18（75mm×4.6mm，3.5μm）的分析效果，结果发现采用前种色谱柱，被测组分的分离度效果较好，且无重叠峰，因此选择前者为分析色谱柱。

3.2 流动相体积比与柱温的优化

为得到最快的分析速度和最好的分离度，本试验比较了0.02mol/L磷酸二氢钾-甲醇流动相在30∶70、35∶65和40∶60不同体积比下的测定结果。结果显示体积比为30∶70时，组分迅速洗脱，但分离度和峰形均不理想；而40∶60体积比下，各组分峰分离度良好，但洗脱时间太长；当体积比为35∶65时，洗脱时间、峰形得以兼顾，且峰2与峰1、峰3与峰2、及峰4与峰3之间的分离度分别为3.8、7.3及6.8，均与杂质达到基线分离（见图2C）。同时，本试验比较了30℃柱温和40℃柱温对测定结果的影响，结果发现在35∶65流动相体积比、40℃柱温条件下，各组分洗脱时间、峰形和分离度都达到最理想的情况。

3.3 样品处理工艺的优化

为使被测组分在测定前充分从样品中提取出来，笔者测试了甲醇直接超声溶解、少量氯仿大量甲醇超声溶解后直接滤过进样的方法，发现超声不能使样品溶解，且进样后峰形欠佳。又考察了甲醇以不同温度（60、70、80℃）溶解样品，溶解后冰浴不同时间（0、30、60、90、120min与8h）后过滤进样，同时考察了样品稀释倍数（1g至10ml、1g至25ml、1g至50ml、1g至100ml）的影响，结果回收率以1g样品用25ml甲醇70℃溶解、冰浴2h以上时最接近100%。

3.4 方法的确定

双氯达克乳膏是医院制剂，目前只有1篇报道用HPLC法同时测定其中氯霉素与丙酸氯倍他索的含量[6]。经本试验验证该方法均用外标法测定氯霉素与丙酸氯倍他索，由于两者含量相差20倍，如果均用外标法测定稳定性不理想，测试样品含量结果易偏高。故本文以该法为基础优化了色谱条件、样品处理方法及工艺，参考《中国药典》[5]引入醋酸氟轻松为丙酸氯倍他索内标，使结果稳定、准确度更高，且可以同时测定2种主药及防腐剂羟苯乙酯的含量。在本方法色谱条件下，几种被测组分达到基线分离、峰形好、分离度高，准确度及回收率均符合要求，各试验中RSD均＜2%。故本方法可以更好地控制双氯达克乳膏的质量。

[1] Sasseville D.Hypersensitivity to preservatives[J].Dermatol Ther，2004，17（3）：251.

[2] Veien NK，Hattel T，Laurberg G.Oral challenge with parabens in paraben-sensitive patients[J].Contact Dermatitis，1996，34（6）：433.

[3] 雍德卿.新编医院制剂技术[M].2版.北京：人民卫生出版社，2004：238-294.

[4] 李中东，张云轩，郭燕萍，等.羟苯酯类防腐剂的不良反应[J].中国药物警戒，2012，9（5）：303.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：102、1031.

[6] 袁杰，张琳，黄雄伟，等.HPLC法同时测定双氯达克乳膏中氯霉素和丙酸氯倍他索的含量[J].中国药房，2010，21（1）：78.