RP-HPLC法同时测定苯甲酸原料药中有关物质苯甲醛和甲苯的含量

章家伟，王辉，孙庆荣，王向峰，雷玉萍，帅放文#（1.湖南尔康制药股份有限公司，长沙410331；2.湖南省药用辅料工程技术研究中心，长沙 410331；3.湖南省食品药品检验研究院，长沙 410001）

苯甲酸是羧基直接与苯环碳原子连接形成的最简单的芳香酸，又称安息香酸，其在医药、食品、化工等方面应用十分广泛，可用于合成制备多种药物、防腐剂以及生产苯酚等。

苯甲酸收录于2010年版《中国药典》（二部）[1]、《欧洲药典》（EP）7.0版、《美国药典》（USP）34-《国家处方集》（NF）29版、《英国药典》（BP）2010年版以及《日本药局方》（JP）16版中，但各国药典均未对苯甲酸有关物质进行检查，也尚未见文献报道苯甲酸有关物质的测定方法。

苯甲酸的工业生产方法主要为甲苯液相空气氧化法[2]，此外，还有三氯甲苯水解法以及邻苯二甲酸酐脱羧法等[3]。以甲苯为原料合成苯甲酸，其杂质主要为副产物苯甲醛以及残留反应物甲苯等。目前，文献报道的苯甲醛的检测方法主要有气相色谱法[4-5]、电位滴定法[6]和分光光度法[7]等；甲苯的检测方法主要为气相色谱法[4]。近年来，已有文献报道采用高效液相色谱（HPLC）法检测苯甲醛[8]以及甲苯[9]。在前人工作基础上，笔者参考文献资料[10-11]，建立了反相（RP）HPLC法同时测定苯甲酸有关物质的方法。结果表明，所建立的方法简便、快捷、结果准确，能有效控制药品质量。

1 材料

1.1 仪器

LC-15C HPLC仪，配有SPD-20AT紫外检测器（日本岛津公司）；XS-205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ2200B/FL0016-01超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

苯甲酸对照品（批号：100419-200301，纯度：100%）、苯甲醛对照品（批号：111650-200802，纯度：100%）均来源于中国食品药品检定研究院；甲苯对照品（美国Sigma-Aldrich公司，纯度：99.8%）；药用级苯甲酸（湖南尔康制药股份有限公司，批号：20110601195、20110701195、20110801195）；工业级苯甲酸（市售，批号：20110601、20110602、20110603）；乙腈为色谱纯，醋酸铵、冰醋酸均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WondasilTM-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（pH 4.0）（80∶20），流速：0.5ml/min；检测波长：254nm；进样量：20μl。

取“2.2”项下苯甲酸、苯甲醛、甲苯对照品溶液及系统适用性溶液进样分析，色谱见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备。分别取苯甲酸、苯甲醛、甲苯对照品适量，加流动相制备成质量浓度分别为4.0mg/ml、4.0μg/ml、3.5μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品贮备液的制备。精密称取苯甲酸原料药适量，加流动相稀释制成质量浓度约为8mg/ml的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 系统适用性溶液的制备。即“2.2.1”项下3种对照品的混合溶液。

2.3 方法学考察

图1 适用性试验高效液相色谱图A.苯甲酸对照品溶液；B.苯甲醛对照品溶液；C.甲苯对照品溶液；D.系统适用性溶液；1.苯甲酸；2.苯甲醛；3.甲苯Fig 1 HPLC chromatograms of applicability testsA.benzoic acid control solution；B.benzaldehyde control solution；C.toluene control solution；D.system suitability solution；1.benzoic acid；2.benzaldehyde；3.toluene

2.3.1 检测波长的选择。分别取制备的苯甲酸（20μg/ml）、苯甲醛（20μg/ml）和甲苯（1.0mg/ml）对照品溶液适量，紫外扫描，结果苯甲酸、苯甲醛和甲苯最大吸收波长分别为225、245、260nm，光谱见图2。

图2 紫外吸收光谱图1.苯甲酸；2.苯甲醛；3.甲苯Fig 2 UV absorption spectrum1.benzoic acid；2.benzaldehyde；3.toluene

为灵敏检测苯甲酸有关物质，所选波长需使3种物质均有较强吸收。参考已有文献[7-9]，取系统适用性溶液适量，分别选择检测波长为230、250、254nm进行试验，各物质峰面积结果见表1。

表1 不同检测波长下3种物质峰面积值结果Tab 1 Peak areas of 3kinds of substances at different detection wavelength

由表1可知，检测波长为230nm时，苯甲酸峰面积最大，苯甲醛峰面积较小，甲苯未检出；检测波长为250、254nm时，苯甲酸峰面积减小，苯甲醛、甲苯峰面积均增大。为灵敏检测苯甲醛和甲苯，故选择检测波长为254nm。

2.3.2 流动相的确定。取系统适用性溶液适量，选择甲醇与乙酸铵（0.02mol/L，pH 4.0）溶液比例分别为90∶10、80∶20、70∶30进行试验。结果，苯甲酸、苯甲醛和甲苯保留时间及分离度见表2。

表2 不同比例流动相及不同流速下3种物质保留时间和分离度结果Tab 2 Retention time and separation rates of 3kinds of substances with different proportion of mobile phase at different flow rates

由表2可知，随着流动相中乙酸铵比例的增加，各物质保留时间随之增加，苯甲酸和苯甲醛的分离度也随之增加。当改变流动相比例从80∶20到70∶30，分离度增加不明显，但甲苯保留时间明显延长。为获得良好的分离度，并缩短色谱分析时间，选择甲醇-乙酸铵溶液（80∶20）作为流动相。

2.3.3 流速的确定。流速的大小对各物质保留时间以及分离度有较大影响，本文考察了流速分别为0.4、0.5、0.6ml/min时对保留时间及分离度的影响，结果见表2。

由表2可知，随着流速的减慢，各物质保留时间随之延长，苯甲酸和苯甲醛的分离度也随之增加。为获得良好的分离度，并缩短色谱分析时间，选择流速为0.5ml/min。

2.3.4 专属性考察。（1）未破坏溶液的配制：精密量取供试品贮备液5ml，加流动相稀释定容至10ml，备用。

（2）酸（碱）破坏性试验：精密取供试品贮备液5ml，置于试管中，加1mol/L HCl（NaOH）溶液2ml，摇匀，置于85～90℃水浴中加热4h，放冷至室温，用1mol/L NaOH（HCl）溶液中和，加流动相稀释定容至10ml，滤过，取续滤液作为酸（碱）破坏溶液。

（3）氧化破坏试验：精密取供试品贮备液5ml，置于试管中，加30%双氧水溶液2ml，摇匀，放置2h，加流动相稀释定容至10ml，滤过，取续滤液作为氧化破坏溶液。

（4）光照破坏试验：精密取供试品贮备液5ml，置于4700lx强光下照射24h，放冷至室温，加流动相稀释定容至10ml，滤过，取续滤液作为光照破坏溶液。

（5）高温破坏试验：精密取供试品贮备液5ml，置于85～90℃水浴中加热4h，放冷至室温，加流动相稀释定容至10ml，滤过，取续滤液作为高温破坏溶液。

取上述6种溶液进样分析，色谱图结果表明该色谱条件下方法专属性较好，详见图3。

图3 破坏性试验高效液相色谱图A.未破坏溶液；B.酸破坏溶液；C.碱破坏溶液；D.氧化破坏溶液；E.光照破坏溶液；F.高温破坏溶液；1.苯甲酸；2.过氧化氢Fig 3 HPLC chromatograms of destructive testA.solution undestroyed；B.solution destroyed by acid；C.solution destroyed by alkali；D.solution destroyed by oxidation；E.solution destroyed by light；F.solution destroyed by high temperature；1.benzoic acid；2.hydrogen peroxide

2.3.5 线性关系与检测限试验。取苯甲醛、甲苯对照品制备成为质量浓度分别为4.0、3.5μg/ml的溶液，再制备成相应的50%、80%、100%、120%、180%的系列溶液，进样。以峰面积积分值（y）为纵坐标、质量浓度（x）为横坐标，得回归方程分别为苯甲醛：y＝94295x－20763（r＝0.9995）；甲苯：y＝2462.9x－482.74（r＝0.9989）。结果表明，苯甲醛、甲苯检测质量浓度线性范围分别为2.0～7.2、1.75～6.30μg/ml。信噪比为3时得苯甲醛及甲苯的检测限分别为0.05、0.2μg/ml。

2.3.6 精密度试验。取“2.3.5”项下100%溶液20μl重复进样6次，记录色谱图及峰面积积分值。结果，苯甲醛、甲苯对应峰面积积分值的RSD分别为1.5%、1.3%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验。分别于制备后0、2、4、6、8h取“2.3.5”项下100%溶液适量20μl，注入色谱仪，记录色谱图及峰面积积分值。结果，苯甲醛、甲苯峰面积的RSD分别为0.97%、1.02%（n＝6），表明溶液在8h内基本保持稳定。

2.3.8 加样回收率试验。精密吸取供试品贮备液9份各5.0ml，分别置于25ml量瓶中，3份1组，分别添加苯甲醛及甲苯对照品溶液适量，加流动相稀释并定容至刻度，摇匀。进样，记录色谱图，计算加样回收率，结果详见表3。

2.4 苯甲醛、甲苯限度的确定

为进一步控制苯甲酸原料药的质量，对原料药中有关物质苯甲醛、甲苯进行控制，结合2010年版《中国药典》（二部）对有关物质的限度要求，建立药用级苯甲酸中有关物质苯甲醛、甲苯的测定方法，方法如下：

供试品溶液的制备：精密称取苯甲酸原料药适量，加流动相稀释制成质量浓度约为4mg/ml的溶液，摇匀，即得。

表3 回收率测定结果（n＝9）Tab 3Results of recovery tests（n＝9）

杂质对照溶液：分别精密称取苯甲醛、甲苯对照品适量，置于同一量瓶中，加流动相稀释制成含苯甲醛4.0、甲苯3.5μg/ml的混合溶液，摇匀，即得。

HPLC条件：色谱柱为C18；检测器为紫外检测器；流动相为甲醇-0.02mol/L乙酸铵（pH 4.0）＝80∶20，流速为0.5ml/min；检测波长为254nm。

限度规定：供试品溶液中苯甲醛、甲苯的峰面积不得大于杂质对照溶液的峰面积（即苯甲醛、甲苯的限度分别为0.10%和0.0875%）。

2.5 样品中有关物质测定

分别吸取对照品溶液和供试品溶液20μl注入色谱仪，记录保留时间及峰面积积分值，外标法计算即得。对3批市售工业级及3批药用级苯甲酸样品进行了检测，结果详见表4。

表4 6批样品中苯甲醛及甲苯含量测定结果（n＝3）Tab 4 Content determination results of benzaldehyde and toluene in 6batches of samples（n＝3）

由表4可见，3批工业级样品中苯甲醛的含量均超出规定的限度，甲苯未检出；药用级样品中均未检出苯甲醛、甲苯，符合药用要求。

3 讨论

孙远华等[4]采用气相色谱法同时测定甲苯氧化产物中的甲苯及苯甲醛。该法需用NaOH处理样品以除去苯甲酸，再用气相色谱法分析甲苯和苯甲醛的含量，操作不便，且NaOH会影响苯甲醛的测定。阚显文等[6]采用现场电位滴定法，用NaOH标准溶液作为滴定剂同时测定苯甲醛和苯甲酸的含量。该法是基于酸碱反应的原理进行测定，专属性差，酸性物质对测定结果会产生较强的干扰。康全影等[7]采用紫外法同时检测苯甲醛、苯甲酸，其混合物在234nm波长处的吸光度值只与两者总浓度有关，250nm波长处的吸光度值与苯甲醛浓度成正比，两者相互影响较大。本文建立了苯甲酸原料药中有关物质苯甲醛、甲苯的检查方法，并规定苯甲醛、甲苯的的含量不得过0.10%和0.0875%，与已有方法相比，该方法简便、灵敏、专属性强，能同时测定3种物质，且各物质之间未见干扰，测定结果准确。此外，苯甲酸在《中国药典》标准中没有设立有关物质苯甲醛、甲苯检查项，故本法的建立有利于药品质量的有效控制。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：437.

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