纳米蜂胶的制备及其对大鼠降血脂和抗氧化功能影响

颜伟玉，谢国秀，丁黄洁，吴小波，王子龙

(1江西农业大学 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045;2江西省职业病防治研究院，江西 南昌 330006)

蜂胶是工蜂从植物幼芽或树干破伤部位采集来的树脂，并混入上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物，被誉为“紫色黄金”[1]。蜂胶富含药理学活性成分，如多酚类黄酮化合物、醛及酮类化合物、萜类化合物、甾类化合物等[2－3]。蜂胶具有广泛药理功效，有天然抗生素之称，具有增强免疫、抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤等生物学活性[4－11]。但蜂胶难溶于水，进入消化道后不易被人体吸收和利用，给临床应用带来了困难。

纳米技术作为科技领域的热门课题，已广泛应用于多个领域。近年来研究发现，采用纳米技术将蜂胶制成纳米颗粒，其理化性质和作用发生了惊人变化，可以有效地改变纳米蜂胶颗粒的表面物化性质，提高蜂胶与水等溶剂的亲和性[12]。与常规的粘稠蜂胶相比，纳米蜂胶有更强的亲水性和更活泼的化学性质，进入人体的消化系统也极易被吸收利用;同时，纳米级的蜂胶颗粒改变了其表面结构，产生具有纳米粒子特有的表面界面效应，从而提高了蜂胶的抗肿瘤、抗氧化、抗病原微生物、抗菌消炎、增强免疫、促进组织再生等广泛的生物学作用。国内不少学者对纳米复合蜂胶的制备工艺进行了探讨[13－17]，并对纳米蜂胶的抑菌性、抗氧化性、抗肿瘤及增强免疫等方面进行了研究[18－19]。李雅晶等采用β－环糊精包埋制备纳米蜂胶，并对纳米蜂胶的体外药剂学性质进行了研究，结果表明载药量达29.65%，包封率为98.82%，药物具有明显的缓效应[20－21]。但对纳米蜂胶降血脂方面的研究甚少，为了探明纳米蜂胶在该方面的功效，本研究将蜂胶制成纳米材料，对大鼠降血脂和抗氧化效果进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠48只，雄性，SPF级，体质量189～217 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(生产许可证号:SCXK(湘)2009－0004)。动物饲养于江西省职业病防治研究院动物房(使用许可证号:SYXK(赣)2008－0003)，动物房温度20～25℃;相对湿度51% ～55%。

1.1.2 药物与试剂 蜂胶，醋酸乙酯，吐温－80，司盘－80，去离子水，胆固醇(上海政翔化学试剂研究所生产);胆盐(北京奥博星生物技术责任有限公司生产);血清胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒和高密度酯蛋白试剂盒由四川省迈克科技公司生产。高脂灭菌饲料:78.2%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆酸钠。由北京科澳协力饲料有限公司提供(生产许可证号:SCXK(京)2009－0012)

1.1.3 主要仪器 Zeta粒度仪(美国BIC公司制造);透射电子显微镜(日本岛津公司);恒温磁力搅拌器;超净工作台;酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米蜂胶的制备方法 本研究以乙酸乙酯为油相，吐温－80和司盘－80为表面活性剂，按一定比例配成纳米蜂胶水分散体系。在乙酸乙酯溶液中加入蜂胶，常温下充分溶解1 d后，制成饱和溶液，取上清液置于烧杯中，按比例加入表面活性剂，在通风橱中用回流管逐滴加入去离子水，同时置于搅拌器上搅拌，混匀。然后在通风橱中挥发1 d，去除乙酸乙酯。

1.2.2 纳米蜂胶粒径的测定 取适量纳米蜂胶用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径进行检测，每个样本测量5次。

1.2.3 粒子表面形态的观察 取纳米粒乳液少量，滴在盖玻片上，自然晾干。喷金后用透射电子显微镜(SEM)观察粒子的表面形态。

1.2.4 溶解度的测定 室温下，用天平称取该蜂胶10.0 g，加入到500 mL的乙酸乙酯溶液中，常温下浸泡并充分溶解1 d，制成饱和溶液，用7 000 r/min，离心15 min，取沉淀用烘箱干燥，测残渣重5.205 g，根据所加蒸馏水的量计算得溶解度为:9.59 mg/mL。

1.2.5 实验剂量与分组 实验设3个剂量组和1个对照组，根据TC值随机分组，每组10只，各组剂量如下:高剂量组800 mg/(kg·d)bw、中剂量组 400 mg/(kg·d)bw、低剂量组200 mg/(kg·d)bw。对照组在喂饲相同饲料的同时，经口给予同量的溶剂。

1.2.6 实验给药及动物处理 大鼠喂饲基础饲料5 d，眼眶取血，测定血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL－C)水平。根据TC水平，随机分为3个给药剂量组和一个对照组，在给予高脂饲料的同时经口给予不同剂量的受试样品。

给药途径:各剂量组每天经口给予受试样品1次，灌胃量1 mL/(100 g)bw，给受试样品时间45 d。对照组给予同量的超纯水。

日常观察:每日观察大鼠的活动、进食及饮水情况，每周用电子称称量大鼠体质量;实验结束前16 h(隔夜)禁食。处死前称体质量并取腹股动脉血，利用试剂盒测定血清TC、TG、HDL－C水平。

1.2.7 H2O2诱导氧化溶血试验 取新鲜抗凝全血，经生理盐水洗涤、离心3次(每次3 000 r/min，5 min，最后1次10 min)，去血浆及白细胞层，制成压积红细胞，加生理盐水配制成体积份数为1%的红细胞悬液。

将每个样本的红细胞悬液分为A、B两管，每管2 mL。A管加2 mL H2O2(终浓度100 mmol/L)混匀。B管加2 mL蒸馏水，混匀。上述两管各于37℃水浴箱温浴30 min。3 000 r/min离心5 min。各管分装入96孔板中，酶标仪以490 nm光波检测。

溶血度=(A管吸光值÷B管吸光值)×100%(1)1.2.8 数据处理 用Dunnett t(2－sided)统计方法，3个剂量组各指标均数均与对照组的均数进行两两比较，检验统计学差异。计量数据采用均数±标准差表示，显著性检验采用单因素方差分析和t检验，显著性差异界限值为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 纳米蜂胶的粒径和表面形态

纳米蜂胶为棕褐色，均匀混浊的液体，其中蜂胶含量为9.59 mg/mL。经激光粒度分析仪测得纳米蜂胶的平均粒径为270 nm。经电镜观察，蜂胶颗粒大小均匀的球形粒子(工作电压75 KV，放大倍数120×1 000)，见图1。

2.2 纳米蜂胶对大鼠降血脂功能影响

2.2.1 纳米蜂胶对大鼠体重的影响 试验期间，各组动物生长情况良好，无异常行为。试验中，中剂量组及高剂量组各死亡1只大鼠，经尸检未见肝、脾、肾、肺、心等器质性病变，考虑为灌胃等实验操作所致。各组剩余大鼠数量均在8～12只的范围内，符合本试验要求。各组大鼠体重稳步增长，每周平均体质量均无显著性组间差异(P＞0.05)。试验终止前，禁食后高剂量组平均体质量(终体质量)与对照组比较显著偏低(P＜0.05)，其余各组无显著性差异(P＞0.05)，结果见表1。

图1 纳米蜂胶扫描电镜照片Fig.1 The SEM micrograph of nanometer propolis

表1 纳米蜂胶对大鼠周平均体质量的影响Tab.1 Effect of nanometer propolis on average weight of rats g

2.2.2 纳米蜂胶对大鼠血脂的影响 试验结束时，模型对照组血清总胆固醇与初始分组时比较有明显提高，有极显著性差异(P＜0.05)，表明本次试验造模成功。喂食蜂胶45 d试验结束时各剂量组与对照组比较总胆固醇有所降低，但未见显著性差异(P＞0.05)。试验结束后各剂量组的高密度脂蛋白及血清甘油三酯与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，结果见表2。

2.2.3 纳米蜂胶H2O2诱导氧化溶血的比较 各试验组大鼠的新鲜红细胞经100 mmol/L的H2O2氧化处理后，均出现轻微溶血，溶血度在1.36% ～1.54%。对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量间均差异不显著(P ＞0.05)。

表2 纳米蜂胶对大鼠血脂的影响Tab.2 Effect of nanometer propolis on lipoidemia of rats

表3 H2O2诱导氧化溶血比较Tab.3 Comparation of hemolysis of red blood cell induced by H2O2

3 讨论

纳米蜂胶溶液制备时采用最大溶解度，所得纳米蜂胶溶液浓度9.59 mg/mL，与鲁传华报道的纳米蜂胶水分散体和李雅晶用β－环糊精包埋制备的纳米蜂胶相比浓度偏低[14，21]，但与杨道锋研究纳米蜂胶对肿瘤细胞杀伤效应中的6 mg/mL浓度相比偏高。所制备的纳米蜂胶径粒为270 nm，分散性较好。

高血脂病是心血管疾病之一，也是导致动脉粥样硬化(AS)和心脑血管病变的重要因素，目前已成为主要的老年疾病，也是当今危害人类健康的主要疾病。曾志将等实验报告指出蜂胶能明显降低高脂血症大鼠血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量[10]。将蜂胶制成纳米颗粒是否可以增强其药效，促进机体吸收，从而增加其降血脂的功效尚不清楚。本实验结果表明，纳米蜂胶高剂量组显著降低了大鼠体重，大鼠血清中的总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白与对照组比较虽有降低趋势，但并无显著差异。分析原因，可能大鼠饲喂纳米蜂胶的最佳剂量需要进一步进行摸索或调整，也可能动物实验周期需要进一步延长才具有显著效果。各实验组大鼠新鲜红细胞H202氧化处理后，均出现了轻微的溶血，但纳米蜂胶组有降低溶血度的趋势，说明食用纳米蜂胶对增强红细胞抗脂质过氧化的能力有一定作用。

[1]曾志将主编.养蜂学[M]2版.北京:中国农业出版社，2009.

[2]黄文诚.蜂胶的化学成分和生物学活性(一)[J].蜜蜂杂志，1998(6):9－10.

[3]黄文诚.蜂胶的化学成分和生物学活性(二)[J].蜜蜂杂志，1998(7):12－14.

[4]Vassya S，Bankova V.Propolis:recent advances in chemistry and plant origin[J].Apidologie，2000，31:3 － 15.

[5]Marcucci MC.Propolis:chemical composition，biological properties and therapeutic activity[J].Apidologie，1995，26:83 －99.

[6]王宗伟.蜂胶的药理作用[J].国外医学:植物药分册，1997，12(4):151.

[7]高春义，张建，赵跃然.蜂胶提取物抗肿瘤作用及对免疫功能的影响[J].中国中医药信息杂志，2000，7(6):27－29.

[8]王宗伟.蜂胶的药理作用[J].国外医学:植物药分册，1997，12(4):151.

[9]田清津，殷莹，李云兰，等.蜂胶降血脂作用的研究[J].老年学杂志，1991，11(6):357 －358.

[10]曾志将，杨明，杨新跃等.CO2超临界和乙醇提取蜂胶对大鼠降血脂效果[J].江西农业大学学报，2006(3):432－435.

[11]颜伟玉，杨明，杨新跃等.不同工艺提取的蜂胶对2型糖尿病大鼠降血糖作用比较[J].福建农林大学学报:自然科学版，2008，37(3):194 －197.

[12]玄红专，顾美儿.纳米蜂胶的研究进展[J].安徽农业科学，2006，34(8):1669 －1671.

[13]李文艳，吉挺.蜂胶和紫苏籽油混合微胶囊的制备工艺[J].食品工业科技，2010(9):242－244.

[14]鲁传华，吴鸿飞，闵智伟.纳米蜂胶水分散体的制备工艺与配方研究[J].中成药，2008，30(5):674－677.

[15]刘红华，玄红专.纳米 TiO2复合蜂胶与蜂胶抑菌效果比较[J].安徽农业科学，2005，33(11):2053，2090.

[16]王嘉军，刘敏霞，王全立.壳聚糖一蜂胶复合纳米乳剂的研制及抑菌活性的检测[J].中国消毒学杂志，2005，22(3):241－243.

[17]杨道锋，朱慧芬，邵静芳等.纳米蜂胶对肿瘤细胞K62，L929，MNK28的杀伤效应及机理研究[J].中国药师，2008，11(3):269－272.

[18]柴家前，王 玲，庞 昕等.纳米蜂胶颗粒对鸡免疫功能的影响[J].畜牧兽医学报，2002，33(4).412－416.

[19]玄红专，吴玉厚，桑青.纳米蜂胶抗氧化活性的研究[J].安徽农业科学，2008，36(9):3500，3515.

[20]李雅晶.纳米蜂胶对实验性2型糖尿病大鼠代谢紊乱与胰岛素抵抗的影响[D].杭州:浙江大学，2006.

[21]李雅晶，胡福良.纳米蜂胶的体外药剂学性质研究[J].中国蜂业，2007，58(7):5－6.