纸纤维固定木瓜蛋白酶的研究及应用

易 喻，李慧娟，陈建澍，梅建凤，朱克寅，应国清

（1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032；2.杭州博林生物技术有限公司，浙江 杭州 300018）

纸纤维固定木瓜蛋白酶的研究及应用

易 喻1，李慧娟1，陈建澍1，梅建凤1，朱克寅2，应国清1

（1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032；2.杭州博林生物技术有限公司，浙江 杭州 300018）

利用纸纤维为载体，制备高活性的固定化木瓜蛋白酶并应用于抗HCG抗体的水解.利用戊二醛交联法，制备固定化木瓜蛋白酶，并通过一系列优化，得到最佳固定化条件，包括pH、给酶量、温度、戊二醛体积分数，将制备的固定化木瓜蛋白酶应用于抗HCG抗体水解并制备F（ab′）2片段.研究表明：反应温度为40℃时，固定化酶在pH 5.0，0.01 mol／L的醋酸缓冲液条件下，给酶量为46 mg／g载体，戊二醛体积分数为0.01%时，固定化酶的酶活达到最高19 250 U／g，相对于优化前1 940 U／g提高了近10倍，成功应用于抗HCG抗体水解制备F（ab′）2片段：经SDS-PAGE电泳检测，F（ab′）2片段达到电泳纯.ELISA反应检测表明：片段仍保留较高的活性，效价为1∶12 000.

抗 HCG抗体；固定化酶；木瓜蛋白酶；F（ab′）2片段；ELISA；纸纤维

酶作为一种高特异性和高催化活性的蛋白质，广泛应用于生物化学、生物医学、工业及生物催化领域，但是游离酶液重复利用性较低，并且很多工业用酶价格也比较昂贵，从而限制了它的应用.酶的固定化便成为酶使用方式的一种有效选择［1］.将酶固定在非水溶性载体上是目前一种比较有发展潜力的固定化方式，它可以提高酶的热稳定性或者pH的稳定性，降低产品纯化的复杂性，有利于酶的重复利用［2－4］.因此，固定化酶技术已被广泛应用于生物催化和生物传感器等领域［5］.酶的固定化载体种类非常丰富，固定化方法也多种多样，其中纸纤维具有廉价易得等特性而被广泛应用，但将其用于木瓜蛋白酶的固定化报道较少，笔者就选用纸纤维为载体，通过戊二醛交联法固定化木瓜蛋白酶，并首次应用于抗人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin HCG）抗体的水解制备F（ab′）2片段.

HCG是一种涎糖蛋白.HCG的合成与分泌与妊娠密切相关，另有许多研究表明：HCG的表达与癌症也密切相关［6－7］，由此表明HCG的检测具有相当高的医用价值.目前制备早早孕所用抗体均为完整的单克隆抗体，但在制备特异性、灵敏度更高的抗独特性抗体时，相对分子质量较小的IgG片段显示出诸多优于完整抗体的特性.这是因为F（ab′）2的相对分子质量是IgG相对分子质量的2／3，且抗体Fc的去除使小分子F（ab′）2产生的空间位阻更少，更有利于抗体与抗原的结合［8］.制备F（ab′）2大多采用胃蛋白酶水解全抗所得，有报道提到胃蛋白酶的溶液pH值较低，容易引起抗体蛋白变性，并且小鼠全抗（IgG1）亚类对胃蛋白酶消化具有抵抗作用［9］，故采用固定化木瓜蛋白酶对抗HCG抗体进行酶切制备F（ab′）2片段.

1 材料与方法

1.1 试 剂

含抗HCG单克隆抗体的小鼠腹水购自杭州博林生物技术有限公司，木瓜蛋白酶购自Sigma，DEAE阴离子交换介质购自美国GE公司，辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG购自珠海百奥生化试剂公司，四甲基联苯胺购自上海丽珠东风生物技术有限公司，辛酸、硫酸铵、醋酸、醋酸钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠等试剂均为市售分析纯.

1.2 仪 器

主要仪器：AKTA purifer（美国GE Healthcare公司），凝胶成像系统Gel Doc XR＋（美国BIO-RAD公司），紫外－可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司，UV-2 000型），酶标仪（美国分子仪器有限公司，Spectramax M2型）.

1.3 载体的制备

将2张滤纸（约60g）剪碎，加入自来水，煮沸，煮烂后用纱布过滤，在纸纤维中加入1 000 mL 0.1 mol／L的NaOH溶液，搅拌2～3 h，水洗至pH将近7.0，抽滤，放置冰箱中备用.取适量纸纤维，按1∶9（g／mL）的比例加入0.5 mol／L的 NaOH 溶液，按1 g／mL的比例补加环氧氯丙烷，60℃水浴搅拌反应30 min，抽滤，用去离子水充分洗涤，抽干.

1.4 木瓜蛋白酶液的制备

精确称取0.01 g木瓜蛋白酶，溶于5 mL pH 5.0，0.01 mol／L醋酸钠缓冲液中，并含有0.5 mL 1 mmol／L DTT及1 mL 2 mmol／L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，37℃反应30 min后对相同缓冲液透析过夜，除去DTT，制得激活的木瓜蛋白酶液.

1.5 酶的固定化方法

纸纤维经环氧氯丙烷活化后，再加入质量浓度为5 g／mL的对苯二胺水溶液，于45℃下反应30 min，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重.以氨化的纸纤维为载体，利用戊二醛载体交联法，制备固定化木瓜蛋白酶.具体方法如下：在锥形瓶中加入0.5 g 载 体，0.01 mol／L 的 醋 酸 缓 冲 液 （内 含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA），以及一定量的木瓜蛋白酶和25%戊二醛溶液，室温下搅拌12 h，抽滤，所制得的固定化酶用0.01 mol／L的醋酸缓冲液充分洗涤，室温下真空干燥至恒重.

1.6 酶活的测定

固定化酶活的测定方法：在试管中加入1 mL的0.01 mol／L 的 醋 酸 缓 冲 液 （pH 5.0，内 含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA），8 mL 2%酪蛋白溶液（pH 7.0），37℃水浴预热5 min，然后加入一定量的固定化酶，于37℃反应30 min后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，震荡后于37℃放置10 min，过滤，测滤液在280 nm处的吸光度对照标准曲线计算酪氨酸产生的量.酶活定义为每分钟产生1μg酪氨酸所需固定化酶的量.酶活计算公式：

式中：A为吸光度；k为标准曲线斜率，k＝0.007 4；n为稀释倍数，n＝15；V为终体积，V＝15 mL；h为酶解时间，h＝30 min.

1.7 抗HCG抗体的粗纯

利用辛酸－硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化.用4倍体积的醋酸缓冲液（60 mmol／L，pH 4.0）稀释腹水，用0.1 mmol／L NaOH 调pH 至4.5.将辛酸（25 μL／mL）逐滴加入样品中，边滴加边搅拌，滴完后继续搅拌30 min，8 000 r／min离心30 min，取上清液按体积比10∶1与10倍PBS混合，用0.1 mol／L的 NaOH 调pH 至7.4，然后加入硫酸铵（0.227 g／mL）搅拌30 min后，6 000 r／min离心15 min，弃上清液，将沉淀悬浮于PBS（起始腹水体积的1／5）中.悬浮液用100倍体积的PBS透析过夜.提纯样品于－20℃保存.为防止提纯过程中抗体被破坏，以上所有搅拌和操作过程均在4℃条件下进行.

1.8 F（ab′）2 片段的制备

1.8.1 抗体的水解

在试管中加入0.01 mol／L的醋酸缓冲液（内含1 mmol／L DTT，2 mmol／L EDTA），40℃水浴预热5 min，然后加入1 g的的固定化木瓜蛋白酶（湿重），40℃反应30 min.抽滤，除去DTT，得到激活的固定化木瓜蛋白酶.之后，将激活后的固定化木瓜蛋白酶与10 mL抗体溶液（质量浓度为1.16 mg／mL）混合，40℃反应12 h后反应终止，抽滤，除去固定化木瓜蛋白酶，取滤液即为水解好的抗体片段溶液.用非还原性的SDS-PAGE检测抗体消化程度.

1.8.2 抗 HCG抗体F（ab′）2片段的纯化

DEAE-Sepharose-FF阴离子交换法，将消化过的anti-HCG对pH 6.5，20 mmol／L的Tris-HCl（A液）透析过夜，然后上用相同缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose-FF阴离子交换柱纯化，用0～100%的B液（A液＋1 mol／L的NaCl）线性离子梯度洗脱，2 mL／min流速收集第一个洗脱峰即为F（ab′）2纯品.

1.8.3 抗 HCG抗体F（ab′）2片段的纯度测定

纯化的F（ab′）2片段在非还原条件下进行SDS-PAGE电泳（凝胶质量分数为10%），电泳结果经考马斯亮蓝R-250染色后，用凝胶成像系统检测，据F（ab′）2片段占所有区带总面积的百分比计算F（ab′）2片段的纯度.

1.8.4 抗 HCG抗体F（ab′）2片段活性的测定

参考纪炜［10］等建立的方法：以 MCYST-LR与BSA的偶联物（MC-BSA）作为包被抗原，2μg／mL 100μL包被酶标板，4℃过夜，弃去包被抗原，PBST洗涤3次后用1%OVA 200μL封闭，37℃孵育1 h.PBST洗涤3次后每孔分别加入100μL，倍比稀释的抗HCG单克隆抗体、F（ab′）2片段及兔阴性血清pH 7.5的10 mmol／L PB稀释液，37℃孵育2 h.PBST洗涤3次后每孔加入100μL羊抗兔酶标二抗工作液37℃孵育1 h，弃去酶标二抗PBST洗涤3次，每孔加入10μL 10 mg／mL四甲基联苯胺的二甲亚砜溶解液与65%25μL H2O2的混合液，37℃避光反应15 min后每孔加入50μL 2 mol／L H2SO4终止反应.在酶标仪上读取450 nm处吸光值，以A阳／A阴＞2.1的最大稀释倍数作为其最终效价.其中，PBS为阴性对照，消化前的IgG作阳性对照.

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶固定化条件的确定

2.1.1 pH对固定化木瓜蛋白酶的影响

在不同pH 的醋酸缓冲液（0.01 mol／L，内含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）加入55 mg木瓜蛋白酶和25%的戊二醛溶液（戊二醛的终体积分数为0.01%），在40℃条件下，与1.2 g预处理过的纸纤维反应12 h，结果见图1.

图1 pH对固定化木瓜蛋白酶的影响Fig.1 Effect of pH on immobilized enzyme activity

结果表明：在pH 5.0条件下，固定化酶的相对酶活是最高的.pH增高或降低，活力和蛋白载量均有所下降.可能是因为中性偏酸的条件下，H＋离子浓度过低或过高均会影响纸纤维的一些结构特征.所以选pH 5.0作为固定化酶最适pH条件.

2.1.2 给酶量对固定化酶的影响

0.01 mol／L pH 5.0 的 醋 酸 缓 冲 液 （内 含1 mmol／L DTT 和2 mmol／L EDTA）加入不同量的木瓜蛋白酶，在温度为40℃、戊二醛体积分数为0.01%的条件下，与1.2 g预处理过的纸纤维反应12 h，结果见图2.

图2 给酶量对固定化酶的影响Fig.2 Effect of enzyme amount on immobilized enzyme activity

结果表明：在一定范围内固定化酶活力随着固定化反应给酶量的增加而提高的.随着载体载酶量的增大，酶分子相互间拥挤造成的空间位阻增大.制备纤维素固定化木瓜蛋白酶时，最佳给酶量位46 mg／g.进一步加大给酶量，固定化酶活未有明显增加.

2.1.3 温度对固定化酶的影响

取55 mg木瓜蛋白酶溶于0.01 mol／L醋酸缓冲液（pH 5.0，内含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）和0.01%的戊二醛溶液中，在不同的温度条件下，与1.2 g预处理过的纸纤维反应12 h，结果见图3.

图3 温度对固定化木瓜蛋白酶的影响Fig.3 Effect of couple temperature on immobilized enzyme activity

结果表明：随着温度的升高，固定化木瓜蛋白酶的活力是逐渐增大的，但是，温度高于40℃时，固定化木瓜蛋白酶活力开始下降.在高温下固定化酶活性部分丧失的可能原因是加速了酶分子的伸展作用和构象变化，从而使固定化酶的相对酶活降低.因此，固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度为40℃.

2.1.4 戊二醛体积分数对固定化酶的影响

戊二醛既是固定化反应的交联剂，同时又是酶的变性剂，不同戊二醛浓度对载体与木瓜蛋白酶的交联反应影响较大.取55 mg木瓜蛋白酶溶于0.01 mol／L醋酸缓冲液（pH 5.0，内含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）和一定体积分数的戊二醛溶液中，在温度为40℃条件下，与1.2 g预处理过的纸纤维反应12 h，结果见图4.

图4 戊二醛体积分数对固定化木瓜蛋白酶的影响Fig.4 Effect of glutaraldehyde volume fraction on immobilized enzyme activity

戊二醛既是固定化反应的交联剂，同时又是酶的变性剂.结果表明：随着戊二醛浓度的增大，固定化木瓜蛋白酶的相对酶活持续下降，这是因为当戊二醛浓度为0.01%时，酶与载体之间交联比较充分，被固定的酶数量多，酶活高；当戊二醛体积分数增大时，过量的戊二醛会与酶的活性中心结合，从而导致过度交联，对酶的破坏性大，使得酶活下降.经计算固定化木瓜蛋白酶酶活达到最高值为19 250 U／g，相对于优化前1 940 U／g的酶活有了显著提升.

2.2 固定化酶的性质

2.2.1 固定化酶的最适反应pH

如图5所示，在不同pH值的0.01 mol／L的醋酸缓冲液（内含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）中，测定了固定化酶和溶液酶对底物酪蛋白的水解活力.固定化木瓜蛋白酶的最适pH为7.0，溶液酶的最适反应pH为9.0，固定化酶较游离酶向酸性范围内移动了2个单位.木瓜蛋白酶作为一种碱性酶，经固定化反应后，具有了更好的耐酸性的特征.这可能由于酶经固定化后，其活性部位的某些基团的解离状态发生了改变.

图5 pH对相对酶活的影响Fig.5 Effect of pH on the relative activity of papain

2.2.2 固定化酶的最适反应温度

如图6所示，在不同温度下的0.01 mol／L的醋酸缓冲液（内含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）中，测定了固定化酶和溶液酶对底物酪蛋白的水解活力.固定化木瓜蛋白酶的最适温度为50℃，溶液酶的最适反应温度为70℃，这说明固定化酶较游离酶在较低的温度下就可以发挥较高的酶活，更有利于在相对温和的条件下进行水解反应，更好的防止底物变性.

2.3 抗体片段及纯度测定结果

由图7可见F（ab′）2片段的相对分子质量为105 000.图7中第1与第2泳道比较可以看出：固定化的木瓜蛋白酶水解抗HCG抗体反应较温和，得到的杂质较少，有利于进一步纯化.图7中第1与第3泳道比较可以看出：经过DEAE柱层析所得F（ab′）2片段已达到电泳纯，即已经将F（ab′）2片段从全抗和Fc片段中分离出来.

2.4 抗 HCG抗体F（ab′）2 片段活性的测定

由图8可以看出：固定化木瓜蛋白酶制备的F（ab′）2片段具有免疫活性，为1∶12 000，与原抗体相比免疫活性有所降低（原抗HCG单克隆抗体效价为1∶24 000）.

图8 ELISA检测F（ab′）2 片段效价Fig.8 Titers of antibody titers for F（ab′）2 fragments determined by ELISA

3 结 论

以廉价的纸纤维为载体经环氧氯丙烷活化后，成功的固定了木瓜蛋白酶，获得了酶固定化的适宜条件.在该方法中，酶与载体结合牢固，不易失活，便于应用过程中的质量控制.优化后酶活从1 940 U／g提升到了19 250 U／g，提升效果显著.制得的固定化酶与游离酶相比，更有利于在较温和的条件下进行反应，从而更好的保证了底物的活性不被破坏.而且，该固定化酶有效的解决了游离酶不易回收的难题，为木瓜蛋白酶进一步工业应用打下良好的基础.首次将纸纤维固定化的木瓜蛋白酶应用于抗HCG抗体水解制备F（ab′）2片段，并取得了成功.所制得的F（ab′）2片段达到了电泳纯，并仍具有较高的活性：效价为1∶12 000.

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Study on the paper cellulose immobilized papain and its exploration

YI Yu1，LI Hui-juan1，CHEN Jian-shu1，MEI Jian-feng1，ZHU Ke-yan2，YING Guo-qing1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Boleyn Biological Technology Limited Company of Hangzhou，Hangzhou 300018，China）

To use paper cellulose as a carrier，immobilization of papain on paper cellulose was studied.Thus，papain was immobilized onto glutaraldehyde-activated paper cellulose under acid conditions.The enzymatic properties，such as proteolytic activity，heat-stability，glutaraldehyde volume fraction，enzyme amount and pH-activity profile，of the immobilized papain preparation were examined.The immobilization conditions were optimized by orthogonal experiments.The prepared products were applied to digest anti-HCG to obtain F（ab′）2fragments.The results indicated that the immobilized enzyme has an high activity at 40℃when the pH of the buffer solution is 5.0 as well as with the glutaraldehyde volume fraction is 0.01%.Besides the enzyme concentration is 46 mg／g.The activity of the products can reach up to 19 250 U／g which are ten times higher than those came from the processes not optimized.The preparation and characterization of the F（ab′）2fragments of anti-HCG are presented in detail.The monoclonal antibody was digested with immobilized papain to produce antibody fragment.The F（ab′）2fragments were then purified by using DEAE-FF size exclusion chromatography.The F（ab′）2fragment（110 KDa）maintained potent suppressive activity and the titer can reaches 1∶12 000.

anti-HCG；immobilized protease；papain；F（ab′）2fragment；ELISA；paper cellulose

R981＋.3

A

1006-4303（2013）02-0147-05

2012-03-20

浙江省科技厅资助项目（2011C23070）

易 喻（1978—），男，湖南岳阳人，讲师，硕士，主要从事生化制药相关研究，E-mail：yiyu1106＠zjut.edu.cn.通信作者：应国清教授，E-mail：gqying＠zjut.edu.cn.

（

陈石平）