马齿苋中总黄酮的提取工艺研究

张特立,于春月

(1.哈尔滨医科大学附属五院药剂科,黑龙江 大庆 163316;2.哈尔滨医科大学大庆校区药学院,黑龙江 大庆 163319)

马齿苋为马齿苋科一年生肉质草本植物马齿苋 Portulaca oleracea L.的干燥全草。别名半支莲、松叶牡丹、太阳花、长命菜等 ,具有清解毒、散血消肿、抗菌之作用[1],主治肠炎、菌痢、痈肿、恶疮、丹毒、蛇虫咬伤、痔疮肿毒、湿疹、急性和亚急性皮炎等多种疾病。马齿苋中的主要成分为黄酮类物质,本文以总黄酮提取率为指标,采用正交试验法分别考察回流提取法及超声提取法中的各影响因素,并通过对比产生最佳提取工艺,该方法科学、可行,为马齿苋的进一步开发利用提供了理论依据。

1 仪器与试剂

UV-7504PC紫外-可见光分光光度计(上海欣茂仪器有限公司);756MC型紫外-可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);SHZ-DIII予华循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);ESJ200-4电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);KH3200DE型数控超声波提取器(昆山禾创超声器有限公司)。

槲皮素对照品购自中国药品生物制品检定所(100081-201007)。马齿苋购自吉林大药房,由哈尔滨医科大学大庆校区药学院魏东华教授鉴定,洗净后放入烘箱干燥后粉成粗粉备用。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品0.0202g,放入100mL容量瓶中,加入50%乙醇适量,置水浴上微热使溶解,放冷,加50%乙醇至刻度。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取马齿苋药材粉末1.0010g,加入50%乙醇30mL,在温度40℃下,超声提取30min,提取两次并将两次滤液合并转移至100mL容量瓶中,用50%乙醇定容。

2.1.3 标准曲线的绘制

准确量取槲皮素对照品溶液各0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0mL置于10mL容量瓶中,用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,以空白溶液为参比,于375nm处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。回归方程为 A=37.542C+0.0279(R2=0.9997)(n=5)。结果表明:槲皮素在0.02～0.08mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验

取对照品溶液 ,采用直接扫描法,于 375nm处连续测定6次吸光度,计算 RSD=0.2%,表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验

按照供试品溶液的制备方法平行制备6份溶液,分别测定吸光度。计算 RSD=2.2%,表明方法的重现性良好。

2.1.6 稳定性试验

取供试品溶液 ,分别于 0min、 20min、40min、1h、 1.5h、2h、3h、4h、5h、6h测定吸光度并计算 RSD,结果样品在3h内RSD＜2%,表明样品3h内稳定,应在该时间内尽快测量。

2.1.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的马齿苋药材5份,分别精密加入槲皮素对照品适量,各份均按样品溶液的制备方法提取,在375nm处测定吸光度,计算得到平均回收率为102.9%,RSD=2.3%。

2.2 正交试验设计

2.2.1 试验设计

采用 L9(34)正交试验设计法,对回流提取法及超声提取法中各影响因素进行了考察 ,因素水平见表1及表2。

表1 回流提取法正交试验因素水平

表2 超声提取法正交试验因素水平

2.2.2 试验结果

取马齿苋粉末约1g,按照表3及表4中条件分别进行试验,并以总黄酮提取率为评价指标,选取最佳提取工艺。结果见表 3和表 4。

从表3及表4可以看出,回流提取法中各因素影响次序为提取时间＞提取次数＞乙醇浓度＞料液比,最佳工艺为A2B3C1D1;超声提取法中各因素影响次序为提取次数＞料液比＞乙醇浓度＞提取时间,最佳工艺为 A3B2C2D1。通过对比发现回流提取法总黄酮提取率普遍偏高,故确定最佳提取条件为:乙醇浓度95%,料液比1:40(g:mL),提取时间1h,提取次数1次,在该条件下得到总黄酮的提取率为0.76%。

表3 回流提取法正交试验设计及结果

表4 超声提取法正交试验设计及结果

3 讨论

3.1 含量测定方法的选择

通过查阅文献发现[2～4],总黄酮的含量测定方法多为紫外分光光度法,根据原理不同又分为亚硝酸钠显色法、硝酸铝显色法和直接扫描法等,要根据样品的实际情况进行选择。前期工作已证实直接扫描法用于测量马齿苋中的总黄酮最为合适,样品和标准品吸收度高,且在同波长处有最大吸收,故本实验选用此法。

3.2 对照品的选择

马齿苋中含有槲皮素、芦丁、山奈酚、金丝桃苷等黄酮类化合物。前期工作证实芦丁和槲皮素对照品在375nm左右处都有最大吸收,但槲皮素对照品比芦丁的更为明显,故选择槲皮素作为对照品。

本文前期通过单因素实验,分别确定了回流提取法和超声提取法中各因素的水平范围,后分别对两种方法进行正交试验,确立了最佳提取工艺后再进行对比,大大增加了试验结果的科学性和可信性,所得结论为马齿苋的进一步研究开发提供了科学依据。

[1]洪海.马齿苋药理作用及临床应用的研究进展 [J].中外健康文摘,2010,7(27):104-105

[2]李春红,田吉,何兵,等.紫外分光光度法测定黄芪总黄酮的含量[J].重庆医科大学学报,2011,36(8):954-956

[3]郑媛媛,李辰,封士兰,等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱析,2011,31(2):548-550

[4]黄春红,殷武平,郝小花.野生马齿苋草粉总黄酮的提取及含量测定 [J].湖北农业科学,2011,50(7):1463-1464