EZH2和P57在肾细胞癌中的表达及临床意义

刘 飞，肖瑞海，洪正东，鲁雄兵，史子敏，习小庆，潘正跃

（南昌大学第二附属医院泌尿外科，南昌 330006）

肾细胞癌（简称肾癌）是最常见的肾脏恶性实体肿瘤，约占成人恶性肾肿瘤的90%以上，其中75%～80%为透明细胞癌[1-2]。目前，我国肾癌发病率占成人全身肿瘤的2%～3%，每年肾癌新发病人数在2.0万～4.7万，且发病率呈逐年上升趋势[3]。肾癌的发生发展是多基因、多阶段及多步骤改变的过程，癌基因激活或（和）抑癌基因失活致瘤作用尤为重要。本研究采用免疫组织化学法检测EZH2和P57在肾癌的表达，探讨其与肾癌临床病理特征间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集南昌大学第二附属医院2004—2005年肾肿瘤初次手术切除并经病理确诊为肾癌的手术存档标本64例，男38例，女26例，平均年龄58.3岁。所有患者术前均未接受任何治疗。按1997年WHO组织学分级标准：高分化（FuhrmanⅠ级+Ⅱ级）14例，中分化（Fuhrman Ⅲ级）23 例，低分化（FuhrmanⅣ级）27例。按AJCC-TNM分期标准：局限性肾癌（T1+T2）36 例，局部进展性肾癌（T3）28 例。 术后伴淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者44例。另取肾癌手术后距肿瘤边缘3 cm以外的正常肾组织和肾外伤后切除的正常肾组织12例作为对照。

1.2 主要试剂

兔抗人EZH2多克隆抗体、兔抗人P57多克隆抗体均购自美国Invitrogen公司，二步法免疫组织化化检测试剂（PV-6000-G）购自美国GBI公司。

1.3 免疫组织化学染色法

采用免疫组织化学二步染色法检测肾癌和正常肾组织标本中EZH2和P57蛋白的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。用磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性标本作阳性对照。采用Image-Pro Plus专业图像分析系统，随机计算5个高倍镜视野中阳性细胞和肿瘤细胞的百分比，阳性细胞比值0%～25%为蛋白阴性表达，＞25%为蛋白阳性表达。

1.4 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计分析，率的比较采用卡方检验；采用Pearson法进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EZH2在正常肾和肾癌组织中的表达

免疫组织化学检测结果示：正常肾组织和肾癌组织的EZH2阳性表达染色主要集中在细胞核，呈棕黄色颗粒状。正常肾组织EZH2阳性表达率为16.67%，肾癌组织EZH2阳性表达率为78.13%，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。EZH2阳性表达率随肾癌临床分期和病理分级升高而增加，且淋巴结转移组EZH2阳性表达水平明显高于无淋巴结转移组，但与患者性别和年龄无关，见表1。

表1 EZH2和P57表达与肾癌临床病理特征的关系 例

2.2 P57在正常肾组织和肾癌组织中的表达

免疫组织化学检测结果示：正常肾组织和肾癌组织中P57阳性表达染色主要集中在细胞浆和部分胞膜，呈棕黄色颗粒状；正常肾组织中P57阳性表达率为75.00%，肾癌组织中阳性表达率为26.56%，正常肾组织中P57阳性表达率明显高于肾癌组织（P＜0.01）。P57阳性表达率随肾癌临床分期和病理分级升高而呈下降趋势，且淋巴转移组P57表达水平低于无淋巴结转移组，但与患者性别和年龄无关，见表1。

2.3 EZH2与P57在肾癌中表达的相关性

EZH2和P57在肾癌组织中的阳性表达率分别为78.13%和26.56%，相关性分析显示，P57和EZH2在肾癌组织中的表达呈显著负相关（r=-0.648，P＜0.05）。

3 讨论

肾癌是最常见的肾脏恶性实体肿瘤。在肾癌患者中，约30%为晚期肿瘤，约30%局限性肾癌患者术后出现转移或复发[4]。肾癌的主要治疗方法为手术，转移性和晚期肾癌的治疗手段包括放疗、化疗、免疫治疗和分子靶向治疗。当前研究[5]已证实，血管内皮生长因子（VEGF）和mTOR信号通路为肾癌分子靶向治疗的有效靶点。2006年，靶向VEGF和mTOR信号通路的药物逐步应用于晚期和转移性肾癌患者的临床治疗，显示出较免疫治疗更为确切的疗效，靶向治疗后患者总体生存期延长至40个月，肿瘤无进展生存期为27个月，但这些药物仍然难以达到并保持长期持久的完全治疗效果。因此急需鉴定出能更好地反映肿瘤生物学行为的肾癌标志物，并能为肾癌基因治疗提供新的更有效的治疗靶点。

EZH2是PRC2复合物的主要成员，EZH2作为转录抑制因子，具有组蛋白甲基转移酶活性，主要介导组蛋白H3-K27甲基化，直接调控DNA甲基化进而沉默许多靶基因。有研究[6]发现，EZH2在前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌及胃癌等多种肿瘤组织中表达异常。与相应正常组织相比，EZH2表达水平在肿瘤组织中异常升高，且其表达水平越高提示肿瘤处于晚期以及预后不良。有研究显示，EZH2表达水平能够为前列腺癌患者的预后提供有价值的指导意义[7]。近来，包括14种被EZH2抑制的靶基因在内的多数抑制标志物被用于预测前列腺癌和乳腺癌患者结局的工具[8]。通过分析乳腺癌患者标本发现，EZH2水平异常升高与乳腺癌侵袭力和肿瘤细胞增殖率增加密切相关[9]；研究结果同样揭示，EZH2可作为乳腺癌患者预后的监测指标，并指出EZH2高表达与侵袭性肿瘤存在显著相关性[6]。

本研究在蛋白水平证实EZH2在肾癌中表达水平上调，在正常肾组织中EZH2极低表达，且伴随肾癌临床分期升高、肿瘤细胞分化程度降低和淋巴结转移的出现EZH2表达率呈明显上升趋势。表明EZH2与肾癌发生和临床进展有关，提示EZH2高表达可能使肾癌细胞不断恶性增殖，且在此过程中肿瘤细胞逐渐获得侵袭转移的恶性表型，最终导致肿瘤临床进展。

EZH2通过何种机制促进肿瘤细胞增殖和迁移目前尚不清楚。有研究[10]表明，P57在众多人类肿瘤中低表达且参与细胞周期和增殖的调节。Yang等[11]研究并提出，P57是EZH2的直接靶点，并且在乳腺癌中因为表观遗传学机制的调控而被抑制表达。因此，本研究在肾癌组织中检测P57的表达，结果发现，P57在肾癌组织中阳性表达率明显低于正常肾组织，且其阳性表达率随肾癌临床分期升高、肿瘤细胞分化程度降低和淋巴结转移的出现呈明显下降趋势，且发现P57与EZH2的表达呈负相关，推测在肾癌中P57可能是EZH2的下游靶基因，提示EZH2可能靶向抑制P57表达而促进肾癌细胞侵袭转移，从而导致肾癌临床进展，但其靶向抑制的具体机制尚需要深入研究。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics，2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63（1）:11-30.

[2] Karumanchi S A,Merchan J,Sukhatme V P.Renal cancer:molecular mechanisms and newer therapeutic options[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2002,11（1）:37-42.

[3] 萧景丹.肾癌新增患者每年逾2万[J].中国社区医师:医学专业,2008,10（9）:41.

[4] Escudier B，Goupil M G，Massard C，et al.Sequential therapy in renal cell carcinoma[J].Cancer，2009，115（10）：2321-2326.

[5] Escudier B，Eisen T，Stadler W M，et al.Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma[J].N Engl J Med,2007,356（2）:125-134.

[6] Fujii S，Ochiai A.Enhancer of zeste homolog 2 downregulates E-cadherin by mediating histone H3 methylation in gastric cancer cells[J].Cancer Sci，2008，99（4）：738-746.

[7] Varambally S，Dhanasekaran S M，Zhou M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer[J].Nature,2002,419（6907）：624-629.

[8] Yu J，Yu J，Rhodes D R，et al.A polycomb repression signature in metastatic prostate cancer predicts cancer outcome[J].Cancer Res,2007,67（22）：10657-10663.

[9] Bachmann I M,Halvorsen O J,Collett K,et al.EZH2 expression is associated with high proliferation rate and aggressive tumor subgroups in cutaneous melanoma and cancers of the endometrium,prostate,and breast[J].J Clin Oncol,2006,24（2）:268-273.

[10] Hu T，Guo H，Wang W，et al.Loss of p57 expression and RhoA overexpression are associated with poor survival of patients with hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep,2013,30（4）：1707-1714.

[11] Yang X,Karuturi R K M,Sun F,et al.CDKN1C （p57） is a direct target of EZH2 and suppressed by multiple epigenetic mechanisms in breast cancer cells[J].PLoS One,2009,4（4）:e5011.