山核桃外壳植物多酚的提取及抗氧化活性研究

方苗利

（浙江医学高等专科学校，杭州，310053）

植物多酚也称为植物单宁，是一类广泛存在于植物叶、果实、根及树皮等部位的多元酚化合物，在医药、食品、化工、农业和材料等领域的广泛应用受到了人们的关注[1]。特别是植物多酚的抗氧化活性近年来更加受到了人们的重视[2-4]。

山核桃又名胡桃，植物胡桃科胡桃属的一种。山核桃是浙江特有，并在全国占有重要地位的名特优产品。山核桃产生的外壳量很大，大部分都废弃在山中，从而污染环境、危害动植物的生存。而山核桃外皮含有酚类、鞣质、有机酸、生物碱、氨基酸、肽、蛋白质、糖、多糖、配糖(甙)、皂甙、甾体、黄酮体、香豆素、萜类内脂化合物和蒽醌类等化合物。2011年，曹鹏飞报道了用有机溶剂法从山核桃外壳中提取植物多酚的研究，并对不同的溶剂、温度、提取时间、固液比对植物多酚提取率进行了详细的讨论，为解决山核桃外壳的综合利用和进一步开展植物多酚化合物的研究提供了思路[5]。

利用山核桃外壳中提取的植物多酚开展抗氧化活性研究，可以进一步扩大山核桃的种植规模，为地方经济服务。因此，在本研究中首先利用水、丙酮水溶液和聚乙二醇水溶液对山核桃外壳植物多酚进行了提取，在此基础上进行了提取物对油脂的抗氧化活性和对1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力的研究。

1 实验部分

1.1 试剂和原料

试剂：乙二胺四乙酸二钠，氨水，氯化铵，醋酸锌，铬黑T，丙酮，乙醇，聚乙二醇400，硫代硫酸钠，氯仿，甲醇，水杨酸，2,6-二叔丁基对甲酚，DPPH，均为市购化学纯。

原料：山核桃外壳。

1.2 植物多酚的提取方法

将30℃烘干除杂质的核桃外壳10 g粉碎，装入250 mL的锥形瓶中，在60℃温度下，加入提取剂80 mL，搅拌浸提10 h后，趁热过滤、洗涤，滤液进行植物多酚含量测定。

1.3 植物多酚含量测定

Zn2+有较好的选择性，只与植物多酚络合。以过量的醋酸锌为络合沉淀剂加到植物多酚溶液内，在pH=10、35℃下反应30min，溶剂内多余的Zn2+以乙二胺四乙酸二钠（EDTA）滴定。1mL浓度1mol/L的醋酸锌消耗EDTA 0.155 6 g。具体步骤参照文献[6]提供的方法，从而计算植物多酚的含量。

1.4 抗氧化性试验

1.4.1 对油脂的抗氧化性

油脂在氧化过程中，氧与不饱和碳链化合生成过氧化物，过氧化物与碘化氢反应使碘离子氧化析出碘，然后用硫代硫酸钠标准溶液测定析出的碘，根据硫代硫酸钠的消耗量可以得到油脂的过氧化值（POV）,通过POV可评价油脂的氧化程度[7-8]：

式中，V1和V2分别为样品和空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，m为样品质量。

将新鲜猪油切成小块，用文火湿法熬炼，双层纱布过滤除去残渣，冷却、密封后放入低温冰箱备用。各取50 g新鲜猪油，1个做空白试验，1个加入山核桃外壳提取物，提取物分别按猪油质量的0.02%、0.2%、0.5%、1%加入，可以加入适量乙醇溶解。置50℃水浴中缓慢加热并搅拌下融化，然后在70℃恒温箱中保存，每12 h搅拌1次，并确保2个样品在同样的环境条件。

测定时，准确称取试样3 g置于250 mL烧瓶中，加30 mL氯仿-冰醋酸混合液，使样品完全溶解。加入1mL饱和碘化钾溶液，轻轻震荡30 s，然后在暗处放置10 min，取出加入100 mL水，摇匀，立刻用1mmol/L的硫代硫酸钠溶液滴定，至淡黄色时加1 mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点。每隔24 h平行测定2个样品的POV，取样时要充分振荡使之混入足够的空气。

1.4.2 清除DPPH自由基活性

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的脂溶性的质子自由基，具有稳定、灵敏和简便等优点，被广泛的应用于评价短时间内的抗氧化性研究。该测定方法是根据在电子供体的存在下，稳定的DPPH自由基由紫色转化为黄色，其色变程度与其接受的电子呈定量关系，清除自由基能力越强，吸光度越小。吸光度采用分光光度计检测[9]。

溶液配制：DPPH样品为0.2 mmol/L的甲醇溶液，提取物分别配成质量浓度1 mg/mL和0.1 mg/mL的甲醇溶液。

分别测定未加样品液的DPPH溶液、样品液和加入样品液反应后DPPH溶液在517 nm下吸光度A0、As和A，计算清除率：

2 结果与讨论

2.1 植物多酚的提取

目前通过文献提供的提取方法，主要是采用水或丙酮的水溶液。从溶剂的回收再利用，或者是溶剂的使用安全考虑，使用聚乙二醇400水溶液作为提取剂，在反应时间为10 h、温度为60℃的条件下进行了提取实验，结果见表1。

表1 植物多酚在不同溶剂中的提取率Tab 1 Extraction yield of plant polyphenols in different solvents

从表1可以看出，直接采用水提取率最高。

2.2 抗氧化性

将山核桃外壳提取物0.010、0.025、0.10、0.25、0.5 g分别加入到50 g猪油中，测定POV，结果见图1。

图1 植物多酚对猪油的POVFig 1 POV results of different plant polyphenols to lard

从图1可以看出，提取物对猪油的氧化具有很好的抑制作用。随着提取物加入量的增加，抗氧化性逐渐增强，当提取物的加入量为0.10 g时，氧化效果最佳。但是随着提取物加入量的再增加，抗氧化效果有些下降。分析认为，多酚类物质自身不稳定，随着提取物量的增加，易发生自身氧化而使抗氧化作用降低；或者是多酚氧化物的颜色对测定结果有些影响。

2.3 清除DPPH自由基活性

山核桃外壳提取物对清除DPPH自由基的测定结果见图2。

图2 植物多酚对清除DPPH自由基的测定结果Fig 2 Determination results of DPPH free radicals removed by plant polyphenols

从图2可以看出，清除率随着提取物的质量浓度的增加而增加，到100 mg/L时，清除率可达到90%以上。

3 结论

通过利用水、丙酮水溶液和聚乙二醇水溶液对山核桃外壳中植物多酚的提取结果表明，水是最佳的提取剂。该方法安全、效果好、无污染，可以变废为宝，有较好的应用价值。

通过山核桃外壳提取的植物多酚对油脂的抗氧化性和清除DPPH自由基的实验结果表明，山核桃外壳提取物对油脂的抗氧化和清除DPPH自由基具有良好的效果。试验中使用的提取物是未经纯化的粗品，经过深加工后，效果会更好。

[1]黄占华,方桂珍.植物单宁的应用及研究进展[J].林产化工通讯,2005,39(5):39-43.

[2]金莹,孙爱东.植物多酚的结构及生物学活性的研究[J].中国食物与营养,2005(9):27-29.

[3]邵芳芳,尹卫平,梁菊.重要的植物多酚及其抗氧化性能的研究概况[J].西北药学杂志,2010(1):66-68.

[4]徐竟一,李姗珊.苹果多酚的抗氧化性研究[J].广西轻工业,2011(5):13-14.

[5]曹鹏飞.山核桃外壳单宁提取的工艺条件研究[J].江西林业科技,2011(4):60-64.

[6]杨文云,李志国,吴昊,等.络合法测定塔拉单宁含量的研究[J].西南林学院学报,1999,19(4):249.

[7]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998:167.

[8]扬惠芳,李明元,沈文.食品卫生理化检验标准手册[M].北京:中国标准出版社,1998:67.

[9]Barry H.Free radicals in biology and medicine[M].Oxford:Charendon Press,1985:37.