凤仙花植株乙醇浸提液和固体粉剂对瘤胃体外发酵代谢参数的影响

王东升，黄江丽，张志红，田晓娟，黄黄，印遇龙，丁建南＊

（1.江西省科学院生物资源研究所，江西 南昌330029；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙410125）

甲烷是主要的温室气体之一，其温室效应是二氧化碳的20～30倍。畜牧业对全球温室效应的贡献率为9%～18%，而反刍动物排放的甲烷约占其中80%［1］。反刍动物通过瘤胃中微生物发酵利用纤维素、半纤维素等结构性碳水化合物，在此过程中产生大量氢气和二氧化碳，而瘤胃中产甲烷菌利用氢气和二氧化碳进行还原反应生成甲烷，甲烷再以暖气的方式经口排出体外。反刍动物瘤胃内生成的甲烷不仅加剧了温室效应，同时也降低了饲料利用率，造成2%～15%饲料总能的损失［2］。因此，减少瘤胃内甲烷的生成对提高饲料能量利用率和改善环境具有重要意义，研究调控反刍动物瘤胃甲烷排放的措施和方法已成为降低温室效应热点之一。反刍动物瘤胃形成后通过不同措施进行微生态调控，降低甲烷的产生，如羔羊28天时前胃功能发育已基本完成，此时可调控瘤胃发酵，降低甲烷排放［3］。减少甲烷排放的途径主要有改变日粮组成，添加脂类物质、抗生素和植物提取物等。研究发现，日粮不同精粗组合对反刍动物瘤胃内挥发性脂肪酸、产气量以及甲烷产生有不同影响［4，5］。添加脂类物质如植物油后，瘤胃pH明显提高，瘤胃微生物活性发生变化，甲烷菌活性受到抑制，甲烷的排放减少，进而提高动物的生产性能和饲料利用率［6］。肉牛日粮中添加葵花籽油，甲烷排放减少22%，总能损失减少21%［7］。莫能菌素是离子载体型抗生素，明显抑制甲烷菌活性［8］，在反刍动物上应用降低体内25%甲烷生成。但是，长期使用莫能菌素会使瘤胃微生物产生适应性，并且畜产品中残留的抗生素对人体健康存在潜在威胁。因此，开发绿色、无污染饲料添加剂越来越受到关注，其中植物提取物研究比较多。绞股蓝和丝兰等含皂甙类植物提取物，不仅减少瘤胃中原虫数量，降低原虫对细菌的吞噬以及甲烷排放，而且调控瘤胃发酵模式，提高饲料能量的利用效率，同时这类物质还有效提高动物机体抵抗力，预防疾病发生，改善动物产品质量［9，10］。

凤仙花（Impatiens balsamina）是凤仙花科凤仙花属植物，为一年生草本植物，主要分布于热带地区及亚热带地区，在中国主要产于西南地区［11］。凤仙花含有丰富的化学成分，主要含有糖类、黄酮类、醌类、甾醇类、香豆素类等多种活性成分，具有抗过敏、抗真菌、抗炎等多种药理作用［12］。本研究小组在筛选降甲烷药用植物时发现，与青蒿（Artemisia annua）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、麻黄（Herba ephedrae）等植物比较，凤仙花具有明显的降甲烷效果［13］。试验采用体外厌氧培养技术，比较凤仙花植株固体粉剂和乙醇浸提液对瘤胃产甲烷、微生物蛋白（MCP）、氨态氮（NH3－N）和挥发性脂肪酸（VFA）等发酵参数的影响，通过这些特征指标的分析，探讨凤仙花作用机理，为以后的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 添加剂和人工饲料 降甲烷添加剂包括凤仙花和莫能菌素。凤仙花为本所植物遗传育种研究室栽培，开花后期整株采收，全株风干后粉碎过1mm筛成为固体粉剂。固体粉剂分别在50℃、70%乙醇中浸泡48h，料液比为1∶4，浸泡之后用超声波提取，超声波频率为20kHz，提取温度为50℃。通过抽滤得到粗提液，在60℃左右将粗提液浓缩到总体积的1／5，即为凤仙花乙醇浸提液。莫能菌素是40%预混剂，购自江西省南昌市兽医防疫站。人工饲料选用黄豆粒、玉米粒和稻草，分别将这3种材料粉碎后过1mm筛备用。

1.1.2 瘤胃液采集 瘤胃液取自装有永久瘤胃瘘管的黄牛，试验动物每天饲喂2次，饲喂时间点为7：00和17：00，自由饮水。2011年5－6月份取样试验。晨饲2h后采集瘤胃瘘管中新鲜瘤胃液，迅速装入充有氮气自封袋中，并用39℃保温瓶带回实验室。将采集的瘤胃液用4层脱脂纱布在大烧杯中过滤，过滤时在厌氧袋中操作，减少微生物与空气的接触。量取所需体积瘤胃液迅速加入到准备好的人工唾液中（瘤胃液与人工唾液体积比为1∶2），制成混合人工瘤胃培养液，人工瘤胃培养液在实验开始前新鲜配制。人工唾液由微量元素溶液、缓冲液、常量元素溶液和还原剂溶液等组成，具体配制参照Menke和Steingass［14］的方法。

1.1.3 瘤胃体外培养装置 本研究使用的体外厌氧瘤胃培养装置是在王全军等［15］所用培养装置基础上改造而成，装置由两部分组成，培养瓶和50mL玻璃注射器（浙江宁波和平注射器厂），两者之间通过带控制阀的软管连接。培养瓶中放入人工瘤胃培养液和饲料，瓶口用反口胶塞密封。在胶塞上插入软管的尖头部分，软管末端连接注射器。用密封带和胶布密封并固定软管的尖头部分，注射器用橡皮筋固定在培养瓶外。注射器每次使用之前用凡士林涂抹注射器，消除注射器内腔和塞之间摩擦。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 采用二因子设计，因子1为凤仙花固体粉剂和乙醇提取物，因子2为添加剂的添加量，添加量设3个梯度，凤仙花乙醇浸提液添加量分别是培养液体积的0.5%，1.0%和2.5%（mL／mL，E1、E2和E3）；固体粉剂添加量分别是培养液体积的0.5%，1.0%和2.5%（g／mL，S1、S2和S3）。试验设正负对照，负对照为无任何添加剂（CK）；正对照为莫能菌素，添加量为30mg／L（M），莫能菌素添加量参考相关文献［16］。每一处理设7个平行，每个培养瓶为一平行，试验连续重复4批次。

1.2.2 体外培养 分别称取稻草粉、玉米粉和黄豆粉0.90g，0.45g和0.15g，组成体外厌氧培养所用人工饲料。将人工饲料送入250mL培养瓶内，按照处理加入不同添加剂。在厌氧操作袋中打开培养瓶，分别向每个瓶中加入人工瘤胃培养液200mL，与人工饲料混合均匀。迅速盖上胶塞，插上软管的尖头部分，打开软管的控制阀，用针头导入高纯氮气，驱赶瓶中剩余空气，确保培养瓶内为厌氧环境。将培养瓶放入（39±0.5）℃恒温培养箱中发酵培养。在12，18和24h记录注射器读数，测定注射器内甲烷（CH4）和二氧化碳（CO2）含量。各个处理的注射器读数与校正对照比较后 （只有培养液没有饲料底物），转变成产气量。公式为：产气量＝Vt－Vi，其中，Vt为各处理发酵t小时的注射器读数，Vi为校正对照发酵t小时的注射器读数。发酵至终点后收集各处理发酵液，测定pH、氨态氮（NH3－N）、微生物蛋白（MCP）和3种挥发性脂肪酸（VFA）。

1.2.3 测定方法 CO2和CH4测定：CO2含量用GASBOARD沼气分析仪（武汉四方光电科技有限公司）测定；CH4用岛津气相色谱仪器测定，测定条件为：HP－INNOWAX（19091N－133）毛细管柱，测定条件为柱温80℃，气化室温度100℃，检测室温度120℃，载气使用高纯氮气。用10μL微量注射器分别抽取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μL甲烷标准气，根据甲烷浓度和其峰面积关系，确定甲烷标准曲线，具体条件参照胡伟莲等［17］方法。

发酵液参数测定：发酵液pH值用梅特勒－托利多酸度计直接测定；NH3－N含量测定采用水杨酸钠－次氯酸钠比色法，具体过程参照冯宗慈和高民［18］的方法；MCP含量测定参照Makkar等［19］分步离心法进行样品的预处理，考马斯亮蓝（G250）比色法测定蛋白含量。测定挥发性脂肪酸含量时，取培养液1mL，加0.2mL浓度为25%的偏磷酸，4℃高速离心（12 000r／min）10min，测定上清液中3种VFA含量。配制6个梯度的乙酸、丙酸和丁酸的混合标样，用于制作标准曲线。气相色谱测定的柱温为180℃，气化室温度为200℃，检测室温度为220℃，具体条件参照相关文献［17］。培养液中VFA主要由乙酸、丙酸和丁酸组成，三者之和为总挥发酸（TVFA）。

1.3 统计分析

数据采用Excel 2003软件进行记录整理，试验结果用平均值±标准误表示，统计分析采用SAS V8软件的Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 凤仙花对产气量的影响

比较不同处理体外培养中的产气量（表1），12h测定结果中，莫能菌素（M）处理的产气量最低，比对照（CK）显著低56.9%，所有凤仙花处理产气量高于CK，凤仙花固体粉剂高浓度处理（S3）比CK高86.9%，同时也显著高于其他凤仙花处理（P＜0.05）。18h产气量中，莫能菌素处理产气量也是最低，固体粉剂3个添加量S1、S2和S3均显著高于凤仙花乙醇浸提液3个处理（P＜0.05）。24h培养结束时，莫能菌素处理依然保持最低，S3处理最高，所有凤仙花处理均显著高于CK和莫能菌素处理（P＜0.05）。比较各处理3次总产气量，凤仙花固体粉剂最高，3个添加量分别比CK高42.4%，57.0%和70.9%，乙醇浸提液3个添加量分别比CK高16.6%，25.2%和32.2%，莫能菌素处理比CK显著低27.8%（P＜0.05）。因此，凤仙花与莫能菌素处理对产气量的影响结果相反。凤仙花2种制剂添加量和产气量之间表现出一定正比关系，添加量低，产气量低，添加量高，产气量也相应提高。

表1 凤仙花乙醇浸提液和固体粉剂对体外发酵产气的影响Table 1 Effects of ethanol extract and plant solid powder of I.balsaminaon gas production in vitro rumen fermentation

2.2 凤仙花对CH4和CO2的影响

比较12hCH4差异（表1），含量最高是CK，莫能菌素处理明显较低，比CK显著低89.7% （P＜0.05）。凤仙花固体粉剂3个处理都为0；乙醇浸提液3个处理分别比CK显著低85.3%，83.8%和95.6% （P＜0.05）。分析18和24h测定结果，CK中CH4含量在所有处理中保持最高，莫能菌素显著低于CK（P＜0.05），分别比CK低84.9%和74.3%。凤仙花固体粉剂S3处理抑制CH4生成，2个较低添加浓度处理中仅有微量CH4；乙醇浸提液3个添加量18h测定结果比CK分别低72.3%，85.6%和97.9%，24h测定结果比CK低32.8%，77.1%和98.0%（P＜0.05）。

CO2变化与CH4相反，与产气量变化趋势相似。不同时间取样测定结果中，莫能菌素处理均为最低，平均比CK低22.6%。在凤仙花2种制剂中，固体粉剂对CO2提高明显，各添加量平均比CK高109.5%，54.5%和89.6% （P＜0.05），乙醇浸提液各添加量分别比CK 高31.8%，44.8%和70.5%。

2.3 凤仙花对pH的影响

发酵培养结束时，测定瘤胃液中的pH，比较所有处理，莫能菌素最高（表2），比CK高0.2%（P＞0.05）；凤仙花处理均比CK低，并且随着添加量的提高，降低更明显。凤仙花乙醇浸提液3个添加量分别比CK低1.9%，2.8%和4.7%，固体粉剂处理分别比CK低3.5%，5.4%和8.4%（P＜0.05）。

表2 凤仙花乙醇浸提液和固体粉剂体外发酵代谢参数的影响Table 2 Effects of ethanol extract and plant solid powder of I.balsaminaon metabolic parameters in vitro rumen fermentation

2.4 凤仙花对MCP和NH3－N的影响

NH3－N和MCP是瘤胃微生物发酵2个重要指标，反映了瘤胃代谢状态。结果显示（表2），CK中NH3－N含量最高，其他处理均显著低于CK（P＜0.05），莫能菌素处理比CK低16.3%，乙醇浸提液3个处理比CK低12.8%，29.7%和48.2%，固体粉剂3个处理比CK低41.1%，52.2%和55.4%。添加量相同时，凤仙花固体粉剂降低效果比乙醇浸提液明显。体外发酵液中MCP结果与NH3－N不同，莫能菌素处理的MCP最低，比CK低1.8%（P＞0.05），凤仙花处理的 MCP均高于CK，固体粉剂3个添加量分别比CK高84.9%，139.7%和199.7%（P＜0.05），乙醇浸提液分别比CK高60.0%，77.4%和94.8%。

2.5 凤仙花对VFA的影响

比较各处理乙酸含量（表2），莫能菌素处理最低，比CK低3.6%（P＞0.05）；凤仙花处理平均比CK高14.9%，比莫能菌素处理高19.3%。凤仙花处理之间没有明显区别，但是2种处理方式表现为先升高后降低趋势，与其他发酵参数变化规律不同。比较丙酸差异，CK含量最低，莫能菌素处理比CK高11.5%（P＞0.05）；凤仙花固体粉剂平均比CK高33.7%（P＜0.05），乙醇浸提液平均比CK高21.4%。结果中看出，丁酸在3种挥发性脂肪酸中所占比例最小，莫能菌素处理的丁酸含量最低，比CK低2.3%（P＞0.05）；固体粉剂平均比CK高12.2%，乙醇浸提液平均比CK高10.7%。比较3种挥发性脂肪酸总量（TVFA），莫能菌素处理最低，比CK低1.4%（P＞0.05）；固体粉剂比CK平均高20.2%，乙醇浸提液比CK平均高12.9%。对于乙酸／丙酸，CK最高，莫能菌素处理比CK低13.5%（P＜0.05），凤仙花固体粉剂比CK平均低11.45%，乙醇浸提液比CK低8.1%。本试验中，凤仙花处理不同程度提高瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量，TVFA也随着3种酸含量的提高而提高，降低乙酸／丙酸。

3 讨论

莫能菌素（Monensin）是反刍动物应用较广的饲料添加剂，具有减少瘤胃甲烷生成、提高饲料转化效率功效。莫能菌素在一定用量内对产气总量影响不明显，但是明显提高二氧化碳含量［16，20］。本试验中，莫能菌素用量在30mg／L时，CH4降低，产气量和CO2也下降，分析认为与用量较多有关。凤仙花不同添加量明显降低CH4含量，剂量越高效果越明显。研究表明，饲料有机物质的消化率与体外培养时的产气量具有高度相关性，产气量越高，表明饲料在瘤胃内的发酵活动越剧烈［21］。凤仙花明显提高产气量和CO2含量，表明添加的凤仙花刺激了瘤胃微生物代谢活动，提高某些微生物活性；另外，当CH4生成受到抑制时，造成CO2和H2等累积［22］。

MCP代谢是瘤胃微生物区系营养代谢的一个重要的组成部分，是反刍动物最主要的氮源供应者［23］。本试验中，体外培养24h后，凤仙花处理MCP测定结果均比CK高。试验结果表明，凤仙花处理刺激了瘤胃微生物代谢活动，加快瘤胃微生物蛋白合成，促进NH3－N向MCP转化。此结果与茶皂素等植物提取物具有减少瘤胃NH3－N浓度、促进MCP合成结论一致［24］。添加莫能菌素降低MCP含量，与莫能菌素抑制革兰氏阳性细菌活性、引起瘤胃细菌数量下降等有关［8］。瘤胃液pH值是反映瘤胃内发酵状况的一项综合指标，pH值过高或过低对瘤胃微生物生长、发育及发酵均有不利的影响［25］。本试验中，莫能菌素pH比CK高0.2%，差异不显著，添加凤仙花引起pH值明显降低，分析原因可能是凤仙花处理影响瘤胃微生物菌群，提高了挥发性脂肪酸（VFA）含量。pH变化与饲料配比有关［26］，本研究中饲料配比对凤仙花引起的pH变化缓冲效果差，在以后研究中需要调整饲料组成和配比。另外，由于试验采用不连续体外发酵，不能及时排除代谢产物而造成大量有机酸类物质累积［27］。有文献报道VFA是反刍动物和瘤胃微生物维持和生长的主要能量来源，瘤胃内各VFA百分率反映瘤胃微生物的发酵类型及养分吸收情况［28］。凤仙花处理提高瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量，TVFA也随着提高，而乙酸／丙酸下降，可能是凤仙花不仅促进饲料能量的利用，而且还改变了瘤胃代谢模式，结果与茶皂甙和延胡索酸二钠效果相同［29，30］。

比较凤仙花乙醇浸提液以及固体粉剂体外瘤胃发酵效果，从CH4、CO2和MCP等数据看，浓度相同时，固体粉剂的效果最好，乙醇浸提液效果较差。当直接添加固体粉剂时，其中含有的少量对多糖、蛋白质等营养物质也被微生物利用，促进瘤胃微生物发酵，所以效果更明显。

4 结论

凤仙花乙醇浸提液和固体粉剂均能有效降低CH4产生，促进NH3－N向MCP转化，添加量高时（2.5%）效果更明显，固体粉剂的效果最好，并且用量较大时，没有副作用。综上所述，凤仙花有望成为反刍动物新型瘤胃发酵调控剂。

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