磁珠法核酸自动提取仪在分子生物学领域的应用

罗 英

（浙江迪安诊断技术股份有限公司，杭州 310000）

自沃森－克里克的DNA双螺旋模型诞生以后，生物学进入到了一个全新的时代，在生物学界，无论是进行病原微生物的检测、物种鉴定，还是进行物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统进化等的研究，首先都需要对核酸进行分离纯化，因此对DNA的提取成为生物医药领域甚至农林牧渔等领域内所有学科进行科学研究的基础。而能否提取出高质量的核酸则是核酸分子生物学试验中的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败［1］。因此核酸提取是分子生物学的基本方法，也是核酸分析中最关键的方法。科学家们因此开出发了一系列的核酸提取方法，包括经典的酚氯仿抽提法，新发展的硅胶膜吸附法、磁珠分离法等。而随着基因诊断在临床疾病的诊断和监测中发挥着日益重要的作用，基因诊断对核酸检测赖以完成的前提技术——核酸提取技术提出了新的要求，高效、便捷、环保、大通量、自动化成为核酸提取技术发展的主流方向。在这种背景下，核酸自动提取仪应运而生，很多公司纷纷推出自己的全核酸自动提取仪器，各种原理的都有，本文将对核酸自动提取仪原理及分类作一概述，重点介绍磁珠法核酸自动提取仪的原理、分类、优势及应用现状。

1 核酸自动提取仪原理及分类

核酸自动提取仪，又叫核酸自动纯化仪，是一种应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸快速提取工作的仪器。根据其提取原理可分为离心柱法和磁珠法两种。离心柱法全核酸自动提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法，通量一般在1～12个样本，操作时间和手工提取差不多，并不能提高实际工作效率，且价格昂贵，不同型号仪器的耗材也不能通用，仅适合经费充足的大型实验室使用。而磁珠法核酸自动提取仪则是以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸分离的原理，再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程。由于其原理的独特性，所以可设计成很多种通量，既可以单管提取，也可以提取8～96个样本，且其操作简单快捷，提取96个样本仅需30～45min，大大提高了实验效率，且成本低廉，因而可以在不同实验室使用。

根据仪器型号大小又可分为两大类：一类是大型的自动化仪器，一般称为自动液体工作站；另一类是小型的自动化仪器，利用封装好的配套试剂自动完成核酸提取纯化的过程。大型自动液体工作站，功能非常强大，可以自动完成液体分液、吸液等工作，甚至可以将扩增、检测等仪器设备整合在一起，一次性实现标本提取、扩增、检测全自动化操作。提取核酸只是其功能的一个应用，因为其设备成本高昂，运行成本高，不太适合常规实验室使用，一般都应用在一次提取大量（至少96个，一般几百个）同一类标本的实验需求上，所以真正得到应用的比较少。而小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊设计来达到自动提取核酸的目的，其仪器设备和运行成本低，操作方便，因而得到越来越多的应用，近年来已有很多种不同机型陆续投放市场。

2 磁珠法核酸自动提取仪的原理、分类及优势

2.1 磁珠法核酸自动提取仪的原理与分类

磁珠法核酸自动提取仪一般可分为磁棒法和抽吸法两种。抽吸法，也叫移液法，就是通过液体的转移来实现核酸的提取纯化，一般通过操作系统控制机械臂来完成移液。其过程与原理包括：1）裂解：在样品中加入裂解液，通过反复吹打混匀及加热，破碎细胞释放核酸；2）吸附：在样品裂解液中加入磁珠，充分吹打混匀，利用磁珠在高盐低pH值下对核酸具有很强亲和力的特点，吸附核酸，在外加磁场作用下，磁珠与溶液分离，利用吸头将液体移出弃至废液槽，吸头弃掉；3）洗涤：撤去外加磁场，换用新吸头加入洗涤缓冲液，反复吹打混匀，去除杂质，在外加磁场作用下，将液体移出；4）洗脱：撤去外加磁场，换用新吸头加入洗脱缓冲液，反复吹打混匀，结合的核酸即与磁珠分离，从而得到纯化的核酸。

磁棒法，即通过磁珠的转移来实现核酸的分离纯化，一般通过仪器里磁棒的运动，来实现磁珠从样本裂解液／结合液到洗涤液，再到洗脱液的转移，从而自动完成核酸分离与纯化的全过程。其过程与原理包括以下几个步骤：1）裂解吸附：在含磁珠的裂解液中加入待处理样品，充分混合，裂解细胞（适当加热有助于细胞的裂解），释放的核酸在高盐低pH值下特异性的吸附到磁珠上，而蛋白质等分子则不被吸附而留在溶液中；2）洗涤：在磁棒的磁场作用下，磁珠与溶液分离，磁棒将磁珠转移至洗涤缓冲液中，经过反复洗涤，去除蛋白质无机盐等杂质；3）洗脱：洗涤结束后，磁棒又将磁珠转移至洗脱缓冲液中，在低盐高pH值下核酸从磁珠上被洗脱下来，最后磁棒又将磁珠移出，即完成核酸的全部提取。

2.2 磁珠法核酸自动提取仪的优势

传统的核酸提取技术包含沉淀、离心等操作，并需要大量的生物样本，这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、收率低，且需接触有毒试剂，因而很难实现自动化操作；而采用磁珠为载体的分离技术，无需离心，无需大量检材，也无需接触酚／氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化操作，30min就能实现样品的快速、高效制备，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。因而磁珠法核酸自动提取仪，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在［2－3］：①能够实现自动化、高通量操作。核酸抽提技术与磁珠自动化完美结合，实现无交叉污染的高通量自动化核酸抽提，目前已有96孔的核酸自动提取仪，能够一次性实现对96个样品的快速处理，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对，这一特点使得传统方法望尘莫及；②操作简单、快速。整个提取流程只有裂解－结合－洗涤－洗脱四个步骤，无需专业培训技术人员，即可从样本中快速高效的提取靶核酸，且大多可以在30～45min内完成；③安全环保。整个提取过程无需用到传统方法中的苯、氯仿等有毒的有机试剂，安全无毒，绿色环保，且采用封闭式空间，将对实验操作人员的伤害降低到最少，完全符合现代环保理念；④高纯度，高得率。磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大，且提取的核酸可直接用于PCR等后续试验；⑤无污染，且结果稳定。采用智能化操作系统，严格控制孔孔之间污染，并采用一次性塑料提取套管，避免不同批次间污染；同时保证实验结果的稳定性和可重复性，避免人工操作引起的差异及错误；⑥成本低廉，便于广泛应用。由于磁珠合成采用的都是低价无机和有机原料，无须特殊的仪器设备，使得最终的合成和研发成本都很低，符合我国的基本国情和经济现状；⑦可以同时处理不同类型的样本，适应了建立DNA数据库所需的不同类型大量生物样本的提取，为我国DNA数据库的建设铺平了道路，打下了基础。

3 磁珠法核酸自动提取仪的选择

随着磁珠在基因检测领域的应用，越来越多的核酸自动提取装置被开发出来。因此如何选择一款合适的核酸自动提取仪，就需要我们根据机器特点并结合实际需求进行认真选择。

磁珠法核酸自动提取仪根据移液特点主要分为磁棒法和抽吸法两大类，而这两种类型的仪器又各有利弊。抽吸法磁珠核酸自动提取仪通过吸头转移液体实现核酸的分离纯化，其优点是：（1）无需提前分装液体；（2）移液过程不会产生因液体掉落造成交叉污染；（3）可以适用于不同的磁珠法核酸提取试剂，即凡是手动法可以操作的试剂基本上都可以在该类仪器上使用。但这类仪器，也有一个很大的缺点：为了尽可能彻底地去除废液，吸头会伸到深孔板孔底，但为了避免去除废液的时候吸走磁珠，吸头又不能靠磁珠太近，因而每次抽废液的时候总会有一小部分液体残留，特别是磁铁设计在底部的装置，因为磁珠被磁铁吸附在深孔板底部，所以吸头不能靠底部太近，这样每次的洗涤液就不能去除完全，而残留的洗涤液中的盐和乙醇／异丙醇会直接影响后面的洗脱效率和PCR成功率；磁铁设计在侧面的装置残留的液体相对较少，但其洗脱的效率却不好，因其仅靠DNA自行溶解到洗脱缓冲液中，所以会需要较长时间，该类96核酸自动提取仪，提取一轮的时间差不多是32通量磁棒法的5倍。另外该类仪器目前主要由国外的一些厂家研制，主要依靠机械臂进行运行，需要专业编程和专业维护，且移液需要很多枪头，因此机器设备成本比较昂贵，所需耗材成本也不低，因而仅推荐经费充足的实验室选用。

磁棒法核酸自动提取仪相对应用较多，通量通常有8、16、32、96通道，相对于抽吸法，磁棒法的最大优点就是：每一步的液体不会残留，因为磁棒只带走磁珠，然后转移到下一个步骤相应的反应孔中，且其编程简单，易维护；不足之处就是需要提前手工加试剂，且不能将手动法磁珠提取试剂直接拿来使用，而需要根据机器特点优化试剂操作。在选择磁棒法提取仪时，我们还需要根据实际试验需要尽可能选择功能更齐全的，比如可以加热、制冷的，且每个加热槽最好独立温控，这样就可以设置加热、裂解、洗脱的不同温度，有助于提高裂解和洗脱效率，而采用制冷装置的则有助于RNA提取过程中避免RNA的降解。最重要的是，带动磁棒的电机要能带动磁棒进行液体的快速混匀和搅拌，这样才能有利于自动化和有助于裂解和漂洗的彻底。磁棒法的通量最好选择32通道，96通道虽然通量更高，但96个磁棒上面的液体在从一个板转移至另外一个板的过程中可能会滴落造成污染，而32通道的磁棒运行轨迹不经过其他样本的上空，不会造成交叉污染。目前国内基本都是该类型的提取仪，机器成本低，且效果也与国外产品相当，比较而言，国产磁珠法核酸自动提取仪成本低廉，供货周期短，且不依赖于进口试剂。

磁珠法核酸自动提取仪国内外有很多种品牌，目前国际市场上的主流品牌有：Thermo的Kingfisher系列、InnuPure®C12／C16、ROCHE 的 MagNA Pure LC、Qiagen的 Biorobot 9604、ABIPrism®6100Nucleic Acid PrepStation、epMotion 5075TMX、QuickGene610等；国内品牌主要有：西安天隆的NP968系列、厦门欧达的 MP－120系列、台湾圆点奈米的Smart LabAssist－32、科华生物的 DP－3000、上海浩源（台湾基亚）的 ChiTaSBSS1200、杭州博日的NPA－32等。

4 磁珠法核酸自动提取仪的应用

磁珠法核酸自动提取仪基于其独特的磁珠分离技术，实现了核酸提取的高通量自动化，是传统手工提取方法的大革命。由于其操作简单、快速，重复性好，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA来，可应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。

4.1 在疾病控制中心的应用

磁珠法核酸自动提取仪可用于解决H7N9禽流感、SARS（Severe Acute Respiratory Syndromes）、儿童手足口病、麻疹病毒等的快速自动化疾病监测系统，提高重大疫情应对响应能力。

2013年春节后，我国突发了H7N9禽流感。面对重大疫情，由国家863计划支持取得的具有自主知识产权的核酸提取仪及配套提取试剂，成功应用于H7N9禽流感筛查工作，实现了从呼吸道分泌物样品中提取H7N9禽流感病毒核酸到检测的自动化过程，为H7N9禽流感筛查提供了快速集成解决方案，有力地支撑了我国应对禽流感的防控工作。

目前，核酸提取仪及配套提取试剂已经在浙江省H7N9定点筛查医院浙江大学第一附属医院，北京市、陕西省、青海省、西安市和湖州市等各级疾病预防控制中心进行了超过2400多例流感样的H7N9病毒核酸提取及筛查。国产的核酸提取仪及试剂产品与国外同类产品相比具有快捷方便、价格便宜、供货期短等优点，适合在大面积筛查中应用。

以上数据来源于国家科技成果网2013年5月1日科技新闻：国产核酸提取检测设备助力H7N9禽流感筛查。

4.2 在输血安全方面的应用

输血是临床上治疗和抢救病人常用的医疗措施，近年来，随着医疗技术的不断进步，安全输血越来越受到人们的重视。而输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，但由于我国是肝炎的高发区，艾滋病亦处于快速发展趋势［4］，为避免病毒感染传播，加强输血安全检查尤为必要，国内外众多采供血机构因此在血液筛选中引入核酸检测（Nucleic acid test，NAT）。应用血液核酸检测技术，对HBV、HCV和HIV等病毒感染者进行检测，可以有效地缩短病毒特异抗原和抗体免疫测定的“窗口期”，并检出病毒变异株，从而降低输血风险，提高输血安全。而核酸提取是NAT检测的重要环节，核酸提取效果直接影响到NAT检测的灵敏度和特异性［5］。因此核酸提取采用的试剂和方法就显得尤为重要。由于在大批量进行血液筛查时手工混样繁琐、难标识，且核酸手工提取技术要求高、操作复杂、耗时，结果重现性差及进口试剂成本高等诸多因素［6］，限制了该技术在我国血液常规筛查中的推广应用。为了进一步提高血液的安全性，很多科研者纷纷尝试将国产自动化仪器及NAT试剂应用到血液核酸筛查中［4］，而磁珠法核酸自动提取仪不仅可以高效的提取血液中的核酸，而且可以进行高通量处理，从而大大缩短操作时间，提高工作效率，因而在血液筛查方面取得了广泛应用。

早在2003年前日本和罗氏公司应用MPLC全自动核酸提取系统应用于血液筛查的研究［7］。2004年叶贤林等［8］人也将磁珠法核酸自动提取仪用于血液筛查中HBV DNA的提取，结果发现该方法灵敏度高，能在1h内迅速完成480例份核酸的提取，大大提高了工作效率。2005年叶贤林等［9］人将磁珠法核酸自动提取仪应用于16 512份血液标本中HBV DNA的提取，并进行基因分型分析，结果取得了良好的应用效果。

4.3 在临床分子诊断领域的应用

磁珠提取纯化系统可快速高通量的处理临床样品，提取的核酸可直接用于后续的分子诊断。采用磁珠法自动核酸纯化仪可以高效便捷地应用于乙肝、丙肝、艾滋病、流行性病毒、感染性病毒等各种病毒、病原体核酸的快速提取。

2003年Julia H等［10］人比较了两种核酸自动提取仪与手工提取试剂盒在提取肠病毒RNA上的效果，结果表明四种方法都可以有效的应用于肠病毒RNA的提取。2004年Deborah Wilson等［11］人比较了磁珠法核酸自动提取仪与其他四种商业化核酸提取试剂从临床样本中提取嗜肺军团菌的效率，结果发现用磁珠法核酸自动提取仪从痰液中提取军团菌的浓度远高于其中三种商业化核酸提取试剂盒提取的核酸。2005年Kurt Beuselinck等［12］人运使用自动样本准备系统通过磁珠从血清或血浆中提取HCV、HBV、CMV和EBV的核酸，提取的核酸直接进行定量PCR，结果与手工操作相比，大大缩短了操作时间，而且结果稳定可靠。2007年K.Loens等［13］人比较了磁珠法核酸自动提取仪与QIAGEN手工法从不同临床样本中提取核酸的效率，结果表明核酸自动提取仪无论是从咽拭子还是从全血中提取核酸，均比手工法产量高。2011年易勇等［14］人比较了国产磁珠法核酸自动提取系统与传统的沉淀离心提取法提取血清HBV DNA的效果，结果表明国产磁珠法核酸自动提取系统对血清HBV DNA的提取效果良好，操作简单，自动化程度高，重复性好，适宜用于临床HBV DNA检测前处理的核酸提取。

5 在法医学领域的应用

对于法医工作而言，核酸提取的效率和稳定性都是十分重要的。磁珠提取纯化系统与专门的法医样品核酸提取磁珠试剂配合使用，可从不同来源的材料中纯化高质量的DNA，包括烟蒂、毛根、干血、指甲、血痕等，最大处理量可达96个样品／每次。

2009年杨电等［4］人应用国产磁珠结合自动化核酸提取仪批量提取血痕、口腔拭子、软骨、口香糖等9 100份生物检测的DNA，结果表明磁珠法自动化核酸提取仪具有实验条件标准统一、操作稳定可靠、重复性好、效率高、速度快、减轻检验人员的劳动强度等优点，可用于案件中常见的大部分生物样本核酸的抽提。

2009年匡金枝等［15］人比较了应用磁珠法核酸自动提取仪与Chelex－100－工作站法、手工法提取1 552份各类涉案检测DNA的效果，结果表明磁珠法核酸自动提取仪提取DNA效果最佳，且较手工操作DNA检测时间可缩减1.25倍。

随着生物和医学技术的快速发展，原有的手工纯化核酸的方法，已经很难满足大规模、高通量的实验要求，因此出现了许多核酸分离纯化的新技术及商品化试剂，其中采用磁珠分离是一种已被证实为高效、简便、易于自动化的可行方法［16］。随着磁珠分离技术在生物科学领域不断普及和广泛的应用［17］，一些生物制品公司将磁珠分离技术用于核酸自动提取，大大提高了核酸提取的效率，降低了人工操作的误差［18］。目前，国外已有数家公司的核酸自动提取系统进入市场；国内一些公司也开始各展所长分别研发核酸提取用磁珠及自动化设备，并有相应的产品上市。目前已有很多研究表明，国产磁珠法自动核酸提取系统的应用效果不逊于现在普遍采用的沉淀离心提取法，因此非常值得推广使用。同国外进口价格昂贵的同类仪器和磁珠试剂相比，仪器试剂的国产化能显著降低使用成本，有利于节省社会财富和卫生资源［14］，因此国产磁珠法核酸自动提取系统具有较好的应用潜力。相信随着核酸检测技术在分子生物学等各个领域的广泛应用，磁珠法核酸自动提取仪在核酸提取中将发挥越来越重要的作用，而各种不同类型的核酸自动提取仪，将为各分子生物学实验室的核酸提取完全实现自动化提供条件。

［1］ 张丽，杨莲茹，吴绍强.核酸提取方法的研究进展［J］.中国动物检疫，2011，28（12）：75－78.

［2］ 王平康，骆延，王光志，等.磁珠法快速提取鉴定 DNA的实验研究［J］.生物学通报，2006，41（6）：50－51.

［3］ 杨电，刘宏，刘超，等.国产磁珠结合自动化工作站批量提取生物检材DNA的应用［J］.中国法医学杂志，2009，24（6）：404－406.

［4］ 叶贤林，孙斌斌，杨宝成，等.自动化核酸扩增技术（NAT）在血液筛查中的应用研究［J］.中国输血杂志，2008，21（11）：837－839.

［5］ 陈晓东，陶志华，周武.核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价［J］.中华检验医学杂志，2002，25（4）：212－214.

［6］ 夏嘉陵，万朝敏.聚合酶链反应自动化的历程及其进展［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2003，24（4）：208－210.

［7］ Meng Q，Wong C，Rangachari A，et al.Automated multiplex assay system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA，hepatitis RNA，and human immunodeficiency virus type 1RNA［J］.J Clin Microbiol，2001，39（12）：2937－2945.

［8］ 叶贤林，王良华，尚桂芳等.血液混样HBV DNA全自动提取方法的应用研究［J］.中华医学研究杂志，2004，4（10）：876－877.

［9］ 叶贤林，周一炎，杨立新，等.血液HBV DNA全自动检测及基因分型分析［J］.中国输血杂志，2005，18（2）：94－95.

［10］Julia H.Knepp，Melissa A，and Geahr，Michael S.Forman.Comparison of Automated and Manual Nucleic Acid Extraction Methods for Detection of Enterovirus RNA［J］.Journal of Clinical Microbiology，2003，41（8）：3532－3536.

［11］Deborah Wilson，Belinda Yen－Lieberman，Udo Reischl.et al.Comparison of Five Methods for Extraction of Legionella pneumopila from Respiratory Specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，2004，42（12）：5913－5916.

［12］Kurt Beuselinck，Marc van Ranst，and J.Van Eldere.Automated Extraction of Viral－Pathogen RNA and DNA for High－Throughput Quantitative Real－Time PCR［J］.Journal of clinical microbiology，2005：5541－5546.

［13］K.Loens，K.Bergs，D.Ursi，etl.Evaluation of NucliSens easyMAG for Automated Nucleic Acid Extraction from Various Clinical Specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，45（2）：421－425.

［14］易勇，赵焕生，贾莉萍，等.国产磁珠核酸自动提取系统对HBV－DNA检测前处理的研究［J］.中国卫生检验杂志，2011，21（8）：1906－1908.

［15］匡金枝，聂同钢，杨智，等.法医物证DNA自动化检验技术体系的研究［J］.中国法医学杂志，2009，24（3）：164－167.

［16］张春艳，游振斌，兰旺仁.ASTAR MP－120核酸自动提取仪的原理及应用［J］.生命科学仪器，2006，4（12）：52－53.

［17］徐晓可，吴清平，张菊梅，等.免疫磁珠分离技术在常见食源性致病菌检测中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（5）：1196－1198.

［18］易勇，敬华.免疫磁珠分离技术在医学检验中的应用［J］.总装备部医学学报，2010，12（4）：239－241.