基于自组装的丝素蛋白材料应用研究进展

王蜀 蒋瑜春 刘祖兰 陈丽嫚 杜亚男 张袁松

（西南大学 纺织服装学院，重庆 400715）

自组装（self－assembly），是指基本结构单元（分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质）自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构［1］。

分子自组装是依赖非共价键分子间作用力自发连接成结构稳定的分子聚集体的过程，其原理是利用分子与分子或分子中某一片段与另一片段之间的分子识别，相互通过非共价作用形成具有特定排列顺序的分子聚合体［2］。分子自组装是在热力学平衡条件下进行的分子重排过程，绝大多数对自组装体系的研究都是在溶液中进行的，因而溶剂对自组装体系的形成起着关键作用。溶剂的性质及结构上的不同都可能导致自组装体系结构发生重大改变，任何破坏非共价键的溶剂，都可能会影响到自组装过程的进行，包括溶剂的类型、密度、pH值以及浓度等［3］。

由于丝素蛋白分子中独特的疏水链与亲水链间隔排列，为其在水溶液中的自组装提供了可能。而且无规状态的丝素蛋白分子在外界条件易于被诱导部分发生转变而聚集，使其能在界面发生可控的自组装，从这个意义上说，丝素是研究大分子自组装的良好材料。近年来研究者对家蚕丝素蛋白的自组装进行了诸多研究，从基础理论到应用实践都取得了一定的成效，本文就丝素蛋白分子自组装应用方法的研究进展进行了总结。

1 分子自组装的方法及应用

分子自组装一直是近几年的研究热点，其研究方法越来越多，应用也越来越广泛。目前分子自组装的研究主要是利用分子自组装技术进行功能膜材料的生产［4－5］。

1.1 分子自组装的主要方法

目前分子自组装的主要方法包括：①基于化学吸附的自组装膜技术，于海峰等人利用化学吸附作用结合光辐射获得一种液晶显示用光定向材料［6］；②基于物理吸附的离子自组装膜技术，如Choi J U等用离子相互作用自组装了非线性光学发色团层状材料［7］；③旋涂方法，1994年Kim等人用旋涂方法在玻璃底物上得到不对称聚联乙炔的自组装膜；④慢蒸发溶剂法，Kunitake和他的合作者首次通过缓慢蒸发水或非质子溶剂获得两亲分子自组装膜；⑤枝接成膜法，若聚合物与溶剂不相容，憎溶剂相互作用使高分子链自组装成有序膜；⑥基底上的有机分子组装，金属、金属氧化物、半导体及无机晶体均可作为基底材料；⑦基于超分子识别的超分子合成等方法。

基于化学吸附的自组装膜技术是利用范德华力连接同层分子，若单层膜表面含有活性基，还可与其他物质反应，形成同质或异质的多层膜；基于物理吸附的自组装膜技术可制取有机分子与其他组分的多层复合超薄膜，比之于化学吸附膜，层层之间强作用力稳定性大大提高；而对于基底上的有机分子自组装，除了产生自组装膜外，还可产生其他结构，且对于不同基底，适用于不同分子的自组装；超分子自组装的驱动力是氢键、配位键、静电作用、疏水作用等，可从小分子前体产生如棒、层、螺旋或笼状的一维至三维结构，不仅可自组装用于生物高分子封装和稳定的囊泡结构，还可自组装成具有分子识别和催化特性的囊状结构。

1.2 分子自组装的应用研究现状

分子自组装的应用越来越得到各国学者的重视，对其各方面的研究进行系统分类，主要应用分为三个方面：纳米材料领域的应用、膜材料方面的应用以及生物科学中的应用［8］。①目前，大分子自组装已被视为构筑具有规则结构功能性纳米材料的主要途径之一［9］。作为一种软物质，高分子纳米材料具有广泛的潜在应用价值，比如可用作涂料、药物输送载体、纳米反应器、污水处理剂、或作为合成规整结构纳米材料的模板等［10－11］。②分子自组装膜，尤其是单分子自组装膜是分子自组装研究最多的方面，Sung ho Kim［12］等研究了TiO2纳米粒子与聚苯酰胺自组装薄膜聚合物膜，这种膜可消除生物污垢。Nirmalya K.Chaki［13］等阐述了SAMs（自组装单层膜）在生物传感器上的应用，说明了单层分子膜的设计对基于SAMs的生物传感器有关键的作用。③由于分子自组装与主客体化学、超分子化学密不可分，故分子自组装最重要的是在生物医学领域的应用，除了已观察到的分子自组装现象，更引人注目的是可在分子水平调控生物材料的自组装功能化界面，因此被广泛应用在生物传感器、分子器件、高效催化材料、医用生物材料领域，酶、蛋白质、DNA等生物分子自组装体系，不仅保持了生物分子独特的生物功能，同时又为信息、电子科学的发展提供了微型化、智能化的材料。

2 丝素蛋白材料自组装的应用研究现状

2.1 丝素蛋白的聚集态结构

家蚕丝素蛋白具有良好生物相容性，且原料来源丰富、提纯方便，易加工成型，将天然蚕丝溶解得到丝素溶液，经加工后可形成纤维／无纺网、薄膜、多孔海绵／凝胶等各种形态的材料。丝素蛋白是蚕丝最主要的组成部分，为一类无明显生理活性的纤维性结构蛋白质，被蚕用作结构性材料，适合从高分子材料角度进行研究。其结晶形态包括silk－I和silk－II，silk－II为以氢键连接的反平行β－折叠结构，其分子链段间组装最为合理，能量处于最低状态，最稳定，因此silk－I极易转变成silk－II结构。一般，丝素蛋白在稀溶液中主要以无规线团存在，在一定外界条件下（如冷冻、加热、浓缩、稀释、溶剂处理、改变pH值、金属离子引入以及施加应力等）都可以诱导其无规线团向更稳定的β－折叠构象的改变。而且，在某些盐和酸存在的条件下，使β－折叠向无规线团转变；或者当丝素蛋白浓度增加，超过某一浓度后，也易将无规线团结构转变为β－折叠构象，且β－折叠结构含量随着丝素蛋白浓度的增加而迅速增加。而在蚕和蜘蛛腺体中丝蛋白溶液是以无规线团／α－螺旋构象形式存在，腺体前部的丝蛋白溶液则处于一种向列型液晶态形式［14－15］。蚕吐丝实际上就是丝蛋白从无规线团／α－螺旋构象转变成β－折叠构象的蛋白质变性过程。研究认为蚕和蜘蛛在纺丝过程中成功地使用了液晶纺、凝胶纺、超拉伸纺、干纺、离子纺和自组装纺等多种纺丝方法。Viney的自组装机理认为，当丝素蛋白溶液在腺体内浓缩时，贮存在丝腺中的球状丝素蛋白分子通过自组装形成线形聚集体，产生各向异性，从而形成超分子液晶。这是一种超分子取向的棒状结构，丝素蛋白分子之间只存在非共价键（盐桥）作用［16］。

2.2 丝素蛋白分子自组装

丝素蛋白的氨基酸疏水侧链和亲水侧链规整相间排列，使丝素蛋白具有水溶性与非水溶性，在一定条件下可双向转化的特质，使其可通过自组装行为，将丝素蛋白制备成纤维、粉末、膜及多孔支架等多种形态，以扩大其应用领域。无规状态的丝素蛋白分子在外界条件诱导下还能部分构象发生转变而聚集，使其能在水溶液及空气－溶液的界面发生自组装。近年来研究自组装丝素纳米微球及支架较多，并广泛应用在生物医药领域。

一定条件下，丝素蛋白可能在水溶液中组装成纳米粒子。Yamada等用原子力显微镜观测到了丝素蛋白溶液中形成的小岛结构纳米级聚集体。Inoue等人也用原子力显微镜观测到了稀溶液中单个丝素蛋白分子折叠形成的棒状结构，及较高浓度下的线状聚集体结构。Shi等［17］采用自组装法制备了粒径953～1525nm的丝素蛋白颗粒，并通过改变聚乙烯醇／丝素／甲醇的体积比，达到调控微粒尺寸和形貌的目的。

组织工程中支架材料要求良好生物相容性、表面相容性、三维多孔结构、一定力学强度、能被生物降解、且原料充足、易于加工成型、可重复制作等。丝素基本满足组织过程中的支架要求，其有良好的生物降解性，且其降解速率与丝素二级结构有关，又因为有多种二级结构，因此可通过调节丝素的二级结构来间接调控丝素材料的降解行为，以满足不同组织再生的需要。张冰等［18］通过调控丝素大分子的自组装形成纳米纤维的组份，研究了该结构的形成对冷冻干燥法制备的丝素多孔材料的孔形态的影响。用添加甘油和真空水蒸气处理两种方法来调控丝素多孔材料的二级结构。通过将丝素溶液在60℃缓慢浓缩处理，AFM（原子力显微镜）观察可知丝素大分子在浓缩处理过程中自组装形成类似纳米纤维的结构。将浓缩处理前后的丝素溶液用冷冻干燥法制备成多孔材料，SEM（扫描电镜）、X射线衍射和红外光谱分析表明，纳米纤维样结构使丝素多孔材料的孔形状较圆整。此法提供了一种在全水溶液环境，没有使用有毒的化学试剂和有机溶剂的条件下制备出孔结构和二级结构可控的含有纳米纤维组分的丝素多孔材料的方法，可望成为组织工程和组织诱导领域提供一种性能优良的新的可选择支架。通过调节丝素蛋白自组装来形成纳米结构也是制备具有纳米结构丝素生物材料的又一种方法。

胶体晶体是单分散的胶体颗粒在胶体中自发形成有序结构，它的自组装过程涉及物理学、化学、材料科学等多学科的领域，使其在光、电、磁等方面表现出优异的性质，已成为国内外研究的热点。胶体颗粒自组装是制备光子带隙材料的重要手段，同时它又是一种理想的模型体系，具有广泛的应用前景。研究发现丝素蛋白作为一种天然的高分子材料，具有优异的生物相容性和可生物降解性，适合于开发生物功能材料。将性能良好的丝素蛋白制备成纳米颗粒，并通过有序自组装形成胶体晶体，如果能形成光子带隙，产生结构色，未来可以在化妆品行业有较高的应用价值，可将其运用于指甲油、唇膏的制备中，其产品将具有无毒、无害、色彩亮丽持久的优势。潘珏璟［19］用盐析法制备丝素纳米颗粒，并采用重力沉降法和电场下的自组装法对丝素纳米颗粒进行自组装研究，用扫描电镜观察丝素纳米颗粒自组装的情况。胶体颗粒的自组装实际上是分子自组装在对象上的延伸和拓展，由于胶体颗粒的制备及自组装的因素，目前材料基本限于球形颗粒，而且对于排列胶体晶体而言，胶体微球的单分散性是一个必要的条件，当分散性大于5%时，将难以形成有序的结构。去溶剂化法是向蛋白质溶液中加入去溶剂化物质，如天然盐或乙醇，当达到去溶剂化的临界水平时，蛋白质大分子链段相互聚集形成凝聚块，从而促使纳米球的形成。

丝素蛋白可塑性强、结构可控，且有良好生物相容性，可制成各种生物材料，例如凝胶、支架、膜、微球等。其中丝素微球可作为药物控释的载体和矿化模板，在药物控释、光学材料及可再生的硬组织替代生物材料领域有很好的应用前景。黄永利等［20］通过控制丝素蛋白在溶液中的微纳米结构，将溶液放在特制带电极的容器中，在低压电场作用下获得由纳米／微米球组成的丝素电凝胶。冷冻干燥后，获得丝素微球，对丝素微球的结构和性能进行表征，为丝素微球的制备提供了一种新的方法，可应用于药物控释载体及生物矿化模板。以异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白作为模型药物，将不同质量的牛血清蛋白与丝素溶液混合后，在电场作用下，使丝素蛋白在正极自组装形成微球的同时，使带有负电荷的模型药物在正极富集，并被包覆进丝素蛋白微球中，结果表明：在1.33pg／ml的药物添加浓度时初始载药率可达到81.7%，药物能在120h内缓慢均衡释放，使电场调控制备丝素蛋白微球体系有望成为缓释带负电荷的蛋白质和基因药物的优良载体。进一步，以丝素微球作为模板，在液态环境下模拟碳酸钙的矿化，研究丝素蛋白作为模板诱导矿化的机理。结果表明：丝素微球作为模板诱导矿化，可以调控碳酸钙的晶型和结构，可望用于药物释放、涂料等多种领域。

2.3 丝素蛋白诱导自组装

丝素蛋白与皮肤胶原蛋白同属结构蛋白，与骨骼的胶原蛋白相似而无明显抗原性，同时丝素蛋白也能诱导骨髓基质细胞黏附，促进骨的生长以及一定的骨诱导性。因此可以作为无机矿化的模板，同时诱导无机离子沉积，在分子水平上控制着无机晶体的成核、生长，形貌、尺寸、取向等，对于无机晶体的生长起着模板和调控的作用。范纯泉等［21］制备了丝素蛋白／纳米羟基磷灰石（SF／nHA）复合材料，通过透射电镜观察，单纯羟基磷灰石呈棒状，丝素蛋白／纳米羟基磷灰石呈束状纤维；也对复合材料的选择区域电子衍射的多晶环图像和能谱分析图谱进行了分析，通过对比两种样品中羟基磷灰石在尺寸和形状上的多样性差异，我们发现在没有丝素蛋白作用下时，形成的羟基磷灰石晶体在长直径度／比值上远远小于复合材料中的羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA），认为丝素蛋白调控丝素蛋白／纳米羟基磷灰石复合材料的自组装形成过程。在氯化钙、水和乙醇溶液中，丝素蛋白纤维可以溶解在溶液中，提供了更多的自由羰基位点，因此，钙离子可以与丝素蛋白上的羰基结合，形成钙离子一丝素蛋白复丝素蛋白／纳米羟基磷灰石复合材料的仿生制备，随后磷酸氢二氨以及氢氧化氨复溶液加入以上反应系统，磷酸根离子可以在钙离子一丝素蛋白复合体位点聚集，过饱和后会生长形成微小的结晶核，在成核之后，羟基磷灰石的纳米晶生长就会从这些活性的成核位点诱发，由于钙离子与丝素蛋白模板上的羰基存在很强的化学反应，丝素蛋白就会诱导轻基磷灰石纳米晶的自组装。

Cheng等［22］人利用再生丝素蛋白作为模板诱导碳酸钙结晶，结果表明，丝素在自组装聚集过程中，丝素大分子能够影响碳酸钙的结晶形态和晶体聚集，提供了一种制备文石晶型的，米粒状丝素蛋白／碳酸钙矿物质的新方法，为丝素蛋白在天然生物矿化过程提供研究方向。丝素蛋白分子本身带有负电荷，并且丝素蛋白分子能够在水溶液中自组装形成纳米球。在中性溶液中，由于负电荷的排斥作用，丝素纳米球能在一定时间内稳定存在而不发生聚集。在电场作用下，由于电极阳极附近的质子浓度增加，溶液的pH值下降，负电荷消失从而使得丝素纳米球快速聚集，形成微球，并随着处理时间的变化，微球尺寸发生改变。

2.4 丝素蛋白／高聚物自组装

吴国成等［23］利用蚕丝蛋白肽链作为亲水性基团，将其引入聚乳酸中，制备了聚乳酸自组装材料PSFLA（丝素／聚－L乳酸共聚物），通过共聚物样品的扫描电镜照片，发现其中间呈现蓬松结构，而表层为致密结构，说明合成的是一种比表面积很大且有一定自组装性能的共聚物［24］。制备投料比为6／1的OLLA／SF（丝肽／乳酸齐聚物）的共聚物，观察其透射电镜照片，可见该共聚物在溶液中形成了直径约为20nm的高分子微球，可能是双亲链段发生自组装导致的。综合扫描电镜和透射电镜分析，结果表明合成的共聚物是含有双亲链段的嵌段共聚物，而且在溶液浇膜过程中，双亲链段能够发生相分离，两相还可以形成自组装。

查震源等［25］以聚L－乳酸和丝素蛋白为原料，锡盐为催化剂，采用固相聚合成功合成了丝素／聚L－乳酸共聚物；以丙交酯和丝素蛋白为原料，锡盐／质子酸体系为催化剂，采用开环聚合成功合成了丝素／L－丙交酯共聚物，为聚乳酸的改性提供了新的方法，减少了环境污染，降低了产品成本。该课题组近年来一直从事PLLA／SF（聚L－乳酸／丝素）改性材料的研究，并研究其自组装体系，以期有效地提高PLLA材料的细胞亲和性，制备具有细胞识别功能的组织工程材料和药物缓释材料［26－27］。刘洪涛等［28］制备了BPU（医用聚氨酯）／蚕丝蛋白超细粉体共混湿纺纤维，通过SEM观察纤维表观形貌，BPU／未脱胶蚕丝蛋白超细粉体湿纺纤维、BPU／自然丝素超细粉体湿纺纤维、BPU／再生丝素超细粉体湿纺纤维三种样品直径与商品PU（聚氨酯）纤维基本相当，因成形条件较为剧烈和牵伸过程不稳，纤维表面显得粗糙，但不同程度地有蚕丝蛋白颗粒和凝结体被包覆在BPU中，这是由于形成丝素一级结构的疏水肽片段间相互作用力构筑成强的网络，使得丝素链自组装成球状簇团。且三种试样BPU所包覆蚕丝蛋白簇团逐渐变得细小同时分布有规则。这些特征表明，自然丝素因分子量较大和分子链较长，相对再生丝素而言更难以排列到BPU中，而未脱胶蚕丝因其所含丝胶一级结构差异（含较多大侧基的氨基酸残基）更难进行弱力组装。王维慈等［27］拟进一步研究材料的制作工艺，并利用SF／PU复合材料的微孔性能，采取粉体耦体技术使复合材料携带适当的抗炎、抗凝药物，来调节材料的抗炎抗凝性能，研究表明，SF超细粉体改性PU材料拥有比传统生物材料优良的组织相容性。通过不同的制备方法，丝素可被制作成粉末、溶液、薄膜、凝胶、多孔状态等形态，改性方法多，开发空间广大。将PU与丝素共混，聚氨酯和丝素分子间存在较强的氢键连接，使共混膜具有独特优良性能，二者相容性好，可取长补短，丝素蛋白能增加聚氨酯材料的强度和弹性。采用低温等离子技术制备非水溶性丝素粉体改性改性医用聚氨酯共混膜，随着丝素粉体质量百分比的增加，共混膜的亲水性逐渐上升，共混膜的表面还可出现独特的微孔结构，使其吸水性和透气性也逐渐提高［29］。

3 结语

目前大多数自组装还是停留在大尺度上，因此考虑通过调节丝素蛋白自组装来形成纳米结构，是制备具有纳米结构丝素生物材料的一种方法，利用丝素蛋白的自组装，调控丝素蛋白的纳米结构，制备同细胞外基质结构相似的多孔支架，以诱导细胞分化和组织再生，有望突破丝素多孔支架研究的瓶颈；纳米结构包括纳米囊和纳米球等，可由自组装方法包裹药物，以及自组装而成高分子胶束等，应用于纳米生物医学研究；通过调节丝素蛋白自组装来形成纳米结构是制备纳米结构丝素生物材料的一种方法，可望为组织工程和组织诱导领域提供一种性能优良的新的可选择支架；利用丝素蛋白／高聚物自组装，可制备两相自组装材料，也可利用丝素超细粉体进行共混改性，以期用于生物医学领域；丝素蛋白能诱导骨髓基质细胞黏附，促进骨的生长，因此可以作为无机矿化的模板，来调控丝素蛋白／纳米羟基磷石灰复合材料的自组装以及诱导碳酸钙结晶，有望在分子水平上控制无机晶体的成核、生长、形貌、尺寸、取向等，并对无机晶体的生长起模板和调控作用。

丝素蛋白作为天然高分子材料，在分子自组装的研究中扮演重要的角色，基于自组装的丝素蛋白材料应用的研究，不但可以拓展丝素蛋白的多元化应用，而且会促进新型材料的发展。

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