水体中微囊藻毒素检测技术研究进展

张从文，李红梅，2，尤继明，2，江 浩，2

（1.江苏省宝应县产品质量监督检验所，江苏 宝应225800；2.江苏省宝应县国家有机食品质量监督检验中心，江苏 宝应225800）

1 引言

我国各种水体富营养化十分严重。水体富营养化导致的蓝藻水华，不仅破坏了健康、平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出微囊藻毒素（Microcystin，MC）［1～7］、节球藻毒素（Nodularia）、束丝藻毒素（Aphantoxin）等多种毒素而对饮用水的安全构成了严重的威胁［8～12］。

在所有蓝藻毒素中MC是淡水中产生量最大、分布最广泛和造成危害最严重的藻毒素类型。微囊藻毒素主要存在于微囊藻（Microcystis）、鱼腥藻（Anabaena）、颤藻（Oscillatoria）和念珠藻（Nostoc）中，也有人从眠状软管藻（Hapalosiphon hibernicus）中分离到了MC。MC正常情况下存在于蓝藻的细胞内，只有当细胞死亡或破裂后才会释放到周围水体中［8，9］。MC基本结构是由7个氨基酸组成的单环多肽，也称7肽单环肝毒素，相对分子量在1000左右，由于多肽可变位置上氨基酸种类的变化，导致了MC的多样性。目前已发现了60多种不同类型的MC。MC均含有一种特殊的3－氨基－9－甲氨基－2，6，8－三甲基－10－苯基－4，6－癸二烯酸 （Adda）。在天然水体中发现最多，检出频率最高，毒性较大的是MC－LR、RR和YR（L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）。

目前，水中微囊藻毒素检测方法很多，大致分为三类：①化学法，包括薄层层析法（TLC），液相色谱法（LC）［13～16］，液质联用法（HPLC－MS）［17～19］，毛细管电泳法（CE）等；②生物法，包括生物体法，酶抑制－蛋白磷酸酶PP1／PP2A法；③免疫化学法，包括放射免疫法（RIA），间接竞争酶联免疫法（idc－ELISA），直接竞争酶联免疫法（dc－ELISA），夹心免疫法（Sandwich－ELISA）。

2 化学法

2.1 薄层层析法（TLC）

薄层层析法是将固定相（如硅胶）薄薄地均匀涂敷在底板（或棒）上，试样点在薄层一端，在展开罐内展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同，形成互相分离的斑点，测定各斑点的位置及其密度就可以完成对试样的定性、定量分析的色谱法。

2.2 液相色谱法（LC）

高效液相色谱具有高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广，更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于各种分析检测中。吴伟文［13］等采用固相微萃取与高效液相色谱法联用技术分析了水溶液中痕量的微囊藻毒素，该方法测定MC－LR（LR型微囊藻毒素）的线性范围为1.00～200μg／L，相关系数为0.999 5，检出限为0.45μg／L，相对标准偏差（RSD）为2.4%，回收率为90%～99%。该方法测定MC－RR（RR型微囊藻毒素）的线性范围为1.00～100μg／L，相 关系数为 0.9988，检 出限为 0.15μg／L，RSD为2.4%，回收率为89%～100%。

郭坚［14］等建立了一种全自动化在线固相萃取－高效液相色谱法快速、准确测定水体中3种痕量微囊藻毒素的新方法。样品用自动进样器连续注入固相萃取小柱完成富集后，通过双梯度高效液相系统中的一个泵（上样泵）实现净化，再通过阀切换将固相萃取小柱切换至分析流路中，用另一个泵（分析泵）将待测物冲洗至分析柱进行测定。检测波长为238nm，进样体积为10mL，整个分析时间为20min。方法在0.5～10μg／L范围线性良好，3种微囊藻毒素的线性相关系数R2＞0.9996，检出限为0.1μg／L（S／N＞3），6次平行测定峰面积RSD＜1.6%，方法可有效应用于水体中痕量微囊藻毒素的测定。

戚莉莉［15］等建立了有效准确的检测方法：流动相体积分数：35%乙腈＋65%水；体积流量：0.8～1.0 mL／min；紫外检测波长239nm；进样量10μL；在该条件下，以HPLC测定MC的检测限值为0.1mg／L。并应用该法分析了2007年太湖蓝藻爆发期间的水样，结果表明方法具有实用性。

张立将［16］等选用甲醇－0.05%三氟乙酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，对MC－RR和MC－LR取得较好分离效果，水样检出限可达0.02μg／L。优化后的前处理、检测方法，对 MC－RR，MC－LR平均回收率分别为88.9%，并且优化了前处理方法－冰乙酸处理法。

2.3 液质联用法（HPLC－MS）

液相色谱－质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

王蕾［17］等以实验室培养铜绿微囊藻为原料，建立了固相萃取富集微囊藻毒素，液相色谱－电喷雾电离质谱测定藻样中的微囊藻毒素 MC－LR的方法。该法绝对检出限为25pg，回收率为70%以上，方法灵敏度高，实用性强。

王超［18］等利用固相萃取富集和净化，经LC分离后，采用DAD和IT MS定性分析，DAD定量分析。在优化的条件下，水中5种微囊藻毒素的检出限为0.1μg／L；3个质量浓度加标水平（0.2、0.8和5μg／L）的平均回收率为52.2%～115.2%，相对标准偏差为1.2%～10.0%。

虞锐鹏［19］等通过固相萃取富集微囊藻毒素，并采用液相色谱－电喷雾电离质谱测定水中的微囊藻毒素－RR，－LR。分别在 m／z为520.4、996.3时，采用选择离子扫描方式，提高检测灵敏度。该法检出限为0.01μg／L；线性定量范围为0.02～20μg／L。该方法灵敏度高，实用性强，可为水质藻毒素风险评价和监测水处理脱毒效能，提供灵敏、准确的分析方法。

化学分析法不仅能定量精确的检测 MCs，可对不同的MC作精确定性定量测定，运用恰当可测到各组分的μg／L级的含量。但是由于化学分析方法需要复杂的前处理过程，并且所需的仪器价格昂贵，限制了它的实际应用。近年来，随着新的萃取技术的出现，固相微萃取技术（SPME）、基质固相分散萃取技术（MSPDE）和免疫吸附萃取技术（IE）等也应用于MCs检测的前处理中。这些技术高效、快速、节省时间，耗费有机溶剂极少甚至不用溶剂，提高了样品中MCs的提取率，保证了检测数据的准确性。

3 生物法

生物分析法用动物急性毒性实验间接推算MC的含量，结果较为直观、快速，但无法用于准确定量测定。蛋白磷酸酶法利用MC能够抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性的特点，以磷酸化蛋白为底物，测定MCs对蛋白磷酸化酶的抑制程度，即测定MCs、磷酸化蛋白、蛋白磷酸化酶反应后释放的磷酸盐的量来检测微囊藻毒素的量。蛋白磷酸酶法可以反映各种毒素的总量、检测灵敏度高而且测定时间较短，在用于环境监测时具有优势。但蛋白磷酸酶法的检测限度是pg级，低于WHO标准，酶反应体系中的很多变量尚未进行量化和建立一个统一的标准，方法选择性较差，对于各种MCs的灵敏度不同，只能测定毒素总量，无法分别测定不同种类毒素的量，也不能够区分微囊藻毒素和其他的蛋白磷酸酶抑制剂，测定的是MCs的总量，如果蓝藻本身具有内源蛋白磷酸酶活性，则有可能使PP1的结果偏低。此外，蛋白磷酸酶价格很昂贵，若自己制备则对设备和操作人员的要求非常高［20］。

4 免疫化学法

免疫检测方法的原理是利用微囊藻毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测。样品处理简单，便于操作，被国内外同行广泛接受。近年来，免疫检测方法已发展出多种单克隆抗体和多克隆抗体，用这两种抗体制成的MCs酶联免疫测试试剂盒已商品化。但是由于这些试剂盒所用抗体一般是针对MC－LR设计，使得它对于MCs其他异构体交叉反应性低，因此试剂盒对于许多天然存在的MCs灵敏度差异较大，不能检测所有的毒素。而且酶联免疫法假阳性出现几率大，重现性差［21］。

5 问题与展望

在所有分析微囊藻毒素的检测方法中色谱法结果稳定可靠，操作简单，是目前应用最多的方法，有广阔地发展前景。但是如何检测毒素国家尚未有一个标准方法，而且，天然水体中通常微囊藻毒素的浓度较低，因此，研究和发展低浓度藻毒素的分析鉴定方法以对其进行监测十分重要。

通过研究不同介质中痕量MC的提取、富集方法，优化样品的前处理过程，利用高效、高灵敏的联用技术和多残留组分确证技术分析MC－RR、LR和YR，并且在此基础上努力研究发展一些简单、快速和便携化的筛选多残留分析技术将有助于水源受富营养化污染的城市之供水部门发展新的水质监测分析技术，控制供水水质，保障人民的安全与健康。

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