HPLC法同时测定江苏引种白芷中5个香豆素的含量

赵友谊，孙 浩，王 鸣，冯 煦

(江苏省中国科学院植物研究所/江苏省药用植物研究开发中心，江苏南京 210014)

中药白芷为伞形科植物白芷［Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.］或杭白芷［Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan］的干燥根［1］，其主要有效成分为香豆素类。具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓功效;用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等。此外白芷还是一种很好的调味辅料和香料，可以食用，也可以用于保健品和化妆品。白芷人工栽培历史悠久，全国各地均有栽培。商品及药用上有川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷之分。经过长期人工栽培和适生性生长，不同产地白芷已明显区别于野生白芷，并形成相对各自独立的产地特性［2］。本文旨在将不同种质来源的白芷引种到江苏后进行栽培种植基础上，利用现代分析技术对其有效化学成分进行研究，以筛选出适合江苏省栽培、香豆素含量高、产量大的优良种质。

1 仪器和材料

1.1 仪器

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，配置UV检测器，色谱数据处理由Agilent化学工作站完成。Ro－di纯水机(锐思捷科学仪器有限公司);KH2200DB型数控超声波清洗器，功率250 W，频率25 KHz(昆山禾创超声仪器有限公司);LiBORAR AEL－200电子分析天平(岛津公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱纯)，由南京化学试剂有限公司提供。

1.3 对照品

以上对照品均为本实验室自行分离纯化所得，经NMR、MS等方法鉴定其结构，HPLC检测纯度，均在98%以上。

图1 5种对照品的名称和化学结构式

1.4 药材

选择川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷等主要白芷品种，每个产地白芷品种收集2～3份。将收集到的种质材料于4月初(春播)及10月初(秋播)栽种于江苏省中国科学院植物研究所苗圃基地，常规种植方式进行田间管理，于次年采收期(七月间)，随机挖取30株检测白芷的生长量及香豆素成分含量。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Phenomenex Gemini C18(250 mm ×4.60 mm，5 μm)色谱柱，柱温30℃;流动相为甲醇－水(70∶30)，流速为 0.8 mL/min，洗脱 30 min;UV 检测波长 λ =310 nm;进样量5 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品比克白芷素2.20 mg、氧化前胡素 1.01 mg、欧前胡素 3.13 mg、珊瑚菜内酯 0.72 mg、异欧前胡素2.64 mg，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，制成浓度分别为0.220 mg·mL－1、0.101 mg·mL－1、0.313 mg·mL－1、0.072 mg·mL－1、0.264 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

新鲜药材切块经66℃烘干，粉碎过4号筛，精密称取药材粉末5 g，用95%乙醇80 mL在水浴85℃加热回流，提取3次，每次2 h。合并提取液，浓缩至干后用甲醇溶解，并定容至25 mL容量瓶中，经0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察

分别吸取混合对照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。各对照品以峰面积Y对相应的浓度X进行线性回归，5个成分的线性方程见表1。

表1 5种香豆素对照品线性关系

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，测定峰面积，按“2.1”项下条件测定含量。结果各标准品含量的RSD均小于2.13%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取杭白芷的同一供试品溶液，在前述色谱条件下分别在 0，2，4，6，8，10，24 h 进样 10 μL，各标准品含量的RSD均小于1.97%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取杭白芷的同一供试品溶液，按“2.3”项下方法重复提取5份，按上述色谱条件测定含量，结果表明各标准品含量的RSD均小于2.05%，表明重复性良好。

表2 5种香豆素成分回收率试验结果

2.8 加样回收率试验

量取已知含量的杭白芷供试品溶液1 mL至10 mL容量瓶，加甲醇定容至10 mL。分别精密加入五种香豆素对照品适量，按供试品项下方法制备，测定各标准品的含量计算回收率，结果见表2。

2.9 样品测定

精密称取各样品5.0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。样品含量在线性范围内时直接进样10 μL，通过回归方程计算含量。生长量=30株白芷根部干重/30。结果见表3，色谱图见图1。

表3 不同种质白芷中5种香豆素成分的含量(%)

图2 对照品及样品的HPLC图

3 讨论

3.1 本实验首次建立了HPLC同时测定白芷根部5个香豆素成分含量的方法，该方法简便、灵敏、准确。

3.2 从实验数据可以看出，不同种质来源的白芷引种至江苏后，其生长量及香豆素含量差别较明显。春播白芷生长量比较:川白芷(春)＞杭白芷(春)＞祁白芷(春)＞禹白芷(春)，秋播白芷生长量比较:川白芷(秋)＞禹白芷(秋)＞杭白芷(秋)＞祁白芷(秋)，五种香豆素总含量比较:川白芷(秋)＞川白芷(春)＞杭白芷(秋)＞杭白芷(春)＞祁白芷(秋)＞禹白芷(春)＞禹白芷(秋)＞祁白芷(春)。由此，从不同种质来源的白芷生长量及香豆素含量考虑，川白芷更适合江苏地区栽培。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社，2010:98.

［2］黄璐琦，王敏，付桂芳，等.中药白芷种质资源的 RAPD分析［J］.中国中药杂志，1999，24(8):457－458.