响应面优化三氯乙酸沉淀测定豆酱游离氨基酸中蛋白质

张 苗，武俊瑞，代金月，邱小玉，岳喜庆*

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

豆酱(soybean paste)是我国四大传统的发酵豆制品之一，它是以大豆为主要原料制成的酱，经自然发酵而成的半流动状态的发酵食品，也称黄豆酱、黄酱或大豆酱[1]。传统发酵豆酱具有独特的风味，豆酱具有独特的风味，其风味是由酿造过程中微生物引起的生物化学反应形成的。把原料中的不溶性高分子物质，分解成低分子化合物，这些物质的相互结合形成了种类繁多的呈味物质[2]。这些呈味物质主要是氨基酸。因此豆酱中氨基酸的种类和数量决定了豆酱的品质，分析其含量和数量就显得尤为重要。

氨基酸自动分析仪对所进样品要求很严格，需要所进样品除去有机酸、脂肪、蛋白等物质。虽然样品溶解在水中后，游离态氨基酸可溶解在水中，但非水解样品溶液中的部分水溶性蛋白经过高速离心仍无法除去，因此需选用蛋白沉淀剂除去经高速离心后仍无法去除的水溶性蛋白[3]。三氯乙酸(TCA)沉淀法原理是：TCA作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚集沉淀[4]。本研究利用蛋白质遇TCA产生沉淀的特点，结合双缩脲比色法测其含量[5]，以此为指标来确定TCA沉淀测定豆酱游离氨基酸中蛋白的最佳实验条件，为氨基酸含量测定提供简便可行的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆酱，采自当地农家自制的传统发酵豆酱，样品保存于密封袋中，4℃冷藏备用。

酪蛋白标准品(生化试剂，纯度≥99%) 北京世纪奥科生物技术有限公司；三氯乙酸(TCA)、氢氧化钾溶液、酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、95%乙醇、四氯化碳(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；混合氨基酸标准溶液、茚三酮 德国Sykam公司；实验用水为超纯水；磺酸型阳离子树脂分离柱(4.6mm×60mm，3μm) 日本Hitachi公司。

1.2 仪器与设备

CR22GⅡ/CR21GⅡ日立高速冷冻离心机 日立工机株式会社本社工厂；KQ-500DB型超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；UV-5100B紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；L-8800全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 样品干燥

样品在恒温干燥箱中55℃烘干至恒质量。

1.3.2 三氯乙酸沉淀蛋白与双缩脲比色法测定蛋白质含量[6-11]

1.3.2.1 标准曲线回归方程的建立

准确称取10、20、30、40、50、60mg酪蛋白标准品分别置于6个50mL离心管内，各加入20.0mL双缩脲试剂，摇匀。静置10min后，以双缩脲试剂调零，540nm波长处测定各标准溶液的吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，以酪蛋白质量浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=0.1759x＋0.0023，r2=0.9994。

1.3.2.2 蛋白质含量的测定

称取1g研磨均匀的豆酱干粉，加入8g/100mL TCA溶液，再充分研磨混匀转移至50mL容量瓶，25℃水浴条件下超声30min，10000r/min离心10min，倾去上清液，沉淀用95%乙醇10mL洗涤。向沉淀中加入四氯化碳2mL和双缩脲试剂20mL，置于超声波清洗器中振荡均匀，静置显色10min，在10000r/min离心20min，取上层清液，540nm波长处测吸光度。试样中蛋白质含量以ρ(g/100g)表示，结果按下式计算，实验平行测定3次。

式中：m0为取样量/mg；A540nm为测得的吸光度。

1.3.3 单因素试验

分别考察沉淀剂TCA质量浓度、沉淀温度、离心转数3个因素对前处理中蛋白质沉淀效果的影响，以蛋白质含量为评定指标。

表1 单因素试验设计Table 1 One-factor-at-a-time design

1.3.4 响应面试验设计

根据单因素试验确定各因素的取值水平范围，结合Box-Behnken试验设计原理，分别选取TCA质量浓度(A)、沉淀温度(B)、离心机转数(C)作为自变量，以蛋白质含量作为响应值设计响应面试验。利用Design-Expert 7.0软件进行回归分析，预测沉淀蛋白质的最佳条件。

1.3.5 游离氨基酸测定

称取研磨均匀的豆酱干粉1g，加入8.3g/100mL的TCA溶液，再充分研磨混匀转移至50mL容量瓶，47℃温度条件下超声波超声提取1h，1726r/min离心30min，取上清液2mL于蒸发皿中蒸干。加入2.5mL 0.02mol/L的盐酸溶液溶解，经0.22μm的滤膜过滤，作为待测液。

色谱条件[12]：色谱柱：磺酸型阳离子树脂分离柱(4.6mm×60mm，3μm)；梯度洗脱：循环时间53min，分离柱柱温57℃，反应柱柱温135℃，缓冲液流速0.4mL/min，茚三酮流速0.35mL/min；通道1：检测波长570nm，采集时间32min；通道2：检测波长440nm，采集时间10min；进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

蛋白质沉淀效果受T C A 质量浓度、沉淀温度和离心转数影响，由图1 可知，T C A 质量浓度在2～10g/100mL时，测定样品中蛋白质含量呈上升的趋势，8g/100mL以后趋于平稳，考虑到过高的TCA会对氨基酸检测带来影响，故选择8g/100mL TCA质量浓度。TCA质量浓度从2～10g/100mL时，酸度逐渐增强，TCA在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐，并作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使蛋白质聚集沉淀[13]。此外，沉淀温度对蛋白质沉淀效果也存在影响，当反应温度从25℃升至65℃时，蛋白质含量增加不明显，可见温度对TCA沉淀蛋白质作用影响不大，这与任国谱等[14]的报道是一致的。但随温度的提高，分子运动速率提高，蛋白质沉淀速率加快，有助于缩短反应时间，综合考虑选择温度45℃。随离心转数的增加，蛋白质含量呈上升的趋势，16000r/min后趋于平稳，当离心转数16000r/min，测定样品中蛋白质含量达到最高值。

图 1 TCA质量浓度(a)、沉淀温度(b)、离心转数(c)对蛋白质沉淀的影响Fig.1 Effect of three factors on protein precipitation

2.2 响应面法优化蛋白沉淀条件

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[15-17]，选择TCA质量浓度(A)、沉淀温度(B)、离心转数(C)，作为响应面优化的考察因素，每个因素取三水平，以(－1，0，1)编码，以测定的蛋白质含量为响应值，设计三因素三水平试验。试验因素及水平见表2。

表2 Box-Behnken试验因素及水平Table 2 Variables and coded values for Box-Behnken design

应用Design-Expert 7.0软件进行Box-Behnken试验设计，依次进行试剂的配制，蛋白质含量测定(每组3个平行)[18-19]，以样品中蛋白质含量为响应值(Y)，进行响应面试验，结果如表3所示。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken design

2.2.2 回归模型的建立及统计分析

根据表3的试验结果，通过Design Expert 7.0软件处理确定回归方程，该试验的回归方程为：Y=23.16＋0.33A＋0.32B＋0.43C＋0.23AB＋0.23AC＋0.25BC－1.43A2－0.95B2－0.83C2(1)

回归模型进行方差分析及可信度分析结果见表4。

表4 回归方程的统计分析Table 4 Statistical analysis of the fitted regression equation

由表4可知，TCA质量浓度和沉淀温度的二次项对蛋白质沉淀效果影响均具显著性(P＜0.01)，离心转数和它的二次项对蛋白质沉淀效果影响也具显著性(P＜0.05)，其他变量影响均不显著(P＞0.05)，无统计学差异。根据α=0.05显著水平剔除不显著项，简化后的回归方程为：

根据表4可知，模型极显著(P＜0.01)，因变量与自变量之间的线性关系显著(R2=0.9445)，模型调整复相关系数R2Adj=0.8447，说明该模型能解释84.47%响应值的变化，拟合程度较好。失拟项不显著(P＞0.05)，说明试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测[20-21]。

2.2.3 蛋白沉淀条件的响应面分析及优化

图 2 Y=f(A，B)响应面立体图及等高线图Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of precipitant concentration and temperature on protein precipitation

图 3 Y=f(A，C)响应面立体图及等高线图Fig.3 Response surface and contour plots showing the effects of precipitant concentration and centrifuge speed on protein precipitation

图 4 Y=f(B，C)响应面立体图及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of temperature and centrifuge speed on protein precipitation

根据回归方程绘制响应面分析图，运用Design Expert 7.0软件对模型进行分析，寻求蛋白质含量的稳定点及对应的因素水平，由图2～4可知，回归模型存在稳定点，稳定点即极大值点，通过对回归模型求一阶偏导，得到各因素A、B、C的编码值为0.1588、0.2283、0.3160，利用编码公式Xi=(Xj－X0)/Δj将上述编码值转变为实际参数为TCA质量浓度8.320g/100mL、沉淀温度47.280℃、离心转数1726.060r/min，考虑实际操作性，将各沉淀工艺参数修正为TCA质量浓度8.3g/100mL、沉淀温度47℃、离心转数1726r/min。此时蛋白质沉淀效果最佳，为23.29g/100g。为了检验回归模型预测的准确性，在所得最佳沉淀条件下进行3组平行实验进行验证，沉淀中蛋白质实际含量分别为23.12、23.09、23.18g/100g，与预测值十分接近，可见该模型能较好地预测实际蛋白质沉淀情况。

2.3 豆酱中游离氨基酸含量测定

图 5 处理后豆酱中游离氨基酸测定色谱图Fig.5 Chromatogram of free amino acids in fermented soybean paste after protein removal

采用最佳蛋白质沉淀操作条件处理后，按照1.3.5节方法测定样品中游离氨基酸含量，结果见图5。

由图5可以看出，豆酱中的氨基酸分离效果很好，并且在检测过程中柱压稳定。

3 结 论

通过单因素试验和Box-Behnken试验，采用响应面分析法优化豆酱中蛋白质沉淀条件，得出沉淀工艺条件参数为TCA质量浓度8.3g/100mL、沉淀温度47℃、离心转数1726r/min，此条件下蛋白质沉淀量可达到23.29g/100g。并采用此法沉淀蛋白质后进行豆酱中游离氨基酸含量测定，各氨基酸分离效果很好，并且柱压稳定，由此可知样品中的蛋白充分的得到清除。

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