微卫星在酿酒酵母研究中的应用

冯 敏，刘延琳*

(西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100)

微卫星DNA由短的核心序列(一般1～6bp)串联重复构成，故也被称为简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)，如(CA)n、(GTG)n等，其中双核苷酸重复最为常见，其次为3个核苷酸或者4个核苷酸的重复。微卫星在真核生物基因组中广泛存在且均匀分布，在酵母中，每100kb就有1.8个微卫星位点[1-2]。自酿酒酵母全基因组序列公布以后，科学家开始构建搜索酿酒酵母微卫星序列的方法，并取得显著成果[2-5]。因微卫星在真核生物基因组中种类多、分布广，呈选择中性和共显性遗传，多态性丰富且在种内高度保守，一些学者已将微卫星位点的组合分析用于酿酒酵母分型和遗传多样性研究，但尚未达到该技术的最大分辨率[6-9]。鉴于此，Legras等[10-11]对41个微卫星位点的多态信息进行评估和筛选，得到6个稳定的高变异微卫星位点，而这6个位点丰富的多态性也在随后其他学者的研究中得到认可。近年来，随着微卫星序列搜索技术、引物开发技术和检测分析技术的不断完善，其在酿酒酵母相关研究中得到了更为广泛的应用，并呈现出广阔的发展前景。

1 微卫星的应用原理

1.1 微卫星位点多态性形成机理

微卫星DNA因其核心序列重复次数不同及重复程度不同形成了每个座位的多态性[12]，而重复次数的差异是DNA复制和修复过程中滑动错配或减数分裂过程中非姐妹染色单体的不等交换所致[13-14]。而微卫星的进化则是通过链滑移而非重组[15]。此外，Messier等[16]认为微卫星序列越长，其多态性也越丰富，其原因是在DNA复制或者修复时，滑动链与互补链碱基错配，如果错配不能修复，将会导致一个或几个重复单位的插入或缺失。而微卫星越长，产生错配的机会越大，微卫星多态性也越丰富。

1.2 微卫星位点分析方法

1.2.1 分析原理

微卫星核心序列两侧的侧翼序列在种内高度保守，这是设计适当引物扩增微卫星核心序列的基础。基于侧翼序列在种内高度的特异性和核心序列因重复次数差异产生的多态性，可使用某微卫星位点的特异引物，以不同个体的基因组DNA为模板，对该位点的核心序列进行PCR扩增。若同源染色体某个微卫星位点的核心序列重复数目相同，则该个体在这个位点是纯合的，否则便是杂合的。

1.2.2 分析方法

微卫星PCR结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管电泳检测或者测序后，通过POPGENE1.32，Microsatellite_tool kit，GENEPOP1.2等软件对微卫星位点的等位基因数、基因杂合度(heterozygosity，H)和多态信息含量(polymorphism information content，PIC)是衡量群体微卫星变异程度的指标)进行统计分析[17-19]。利用AMOVA、NTSYSpc 2.0、PHYLIP3.6等分析酿酒酵母菌株亲缘关系、酿酒酵母群体的遗传关系等[20-22]。

1.2.3 酿酒酵母研究中常用微卫星位点信息

常用微卫星位点信息见表1。

2 微卫星在酿酒酵母分类鉴定中的应用

2.1 微卫星用于鉴定酿酒酵母

Schuller等[28]分别用6个微卫星位点PCR、interdelta序列分析和线粒体DNA HinfⅠ酶切3种方法考察23株商业酵母，每种方法均得到21种基因型，Schuller指出这3种方法均可作为鉴定酿酒酵母的常规方法在酿酒工业中广泛应用。Vaudano等[29]利用3个微卫星位点多重PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳，对30株酿酒酵母商业菌株进行区分，其中除DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST两株菌之外，其余28株菌表现出明显的带型差异。此外，他还对所选微卫星标记的稳定性及实验方法的可重复性进行验证，指出微卫星标记稳定性好，灵敏度高，可用于检测工业发酵中野生酵母的污染。Howell等[26]通过微卫星位点SC8132X对6个酿酒酵母群体进行分型，得到4个多态类群，从中选择3种不同分型的菌株混合发酵，利用微卫星PCR对发酵过程中酿酒酵母种群进行监控，指出发酵是一个动态变化过程，发酵始末酿酒酵母群体结构存在差异。Pérez等[9]从10个微卫星位点中选出6个高多态性位点，对来自不同酒厂的51株酿酒酵母进行区分，得到57个等位基因和44个基因型。Pérez指出多个微卫星位点组合分析具有很高的分辨率。González Techera等[23]曾对乌拉圭的6株本土酿酒酵母和3株商业酿酒酵母进行区分，通过3个微卫星位点PCR扩增和多态性分析，成功区分上述9个菌株。他认为由于微卫星分型结果可转换为数量数据，故比其他分型技术具有更大的优越性，并提议可将该方法作为鉴定酿酒酵母的常规方法。

2.2 微卫星用于构建酿酒酵母菌株分型数据库

Jubany等[24]曾提出基于微卫星位点和SNPs对酿酒酵母菌株进行分型的标准方法，他们利用从33个微卫星位点中筛选出的9个高多态性位点对120个菌株进行分析，并结合FLO8的SNPs分析，初步构建酿酒酵母菌株微卫星和SNPs分型数据库(www.pasteur.edu.uy/yeast)，旨在收集和规范来自不同实验室的数据。Jubany选择S288C和AB972作为参考菌株，供试菌株某位点的分析结果以其与参考菌株该位点的重复数差异来表示，比如，+4表示供试菌株比参考菌株在该位点多4个重复，而－7则表示比参考菌株少7个重复。这种用重复数差异来表示等位基因的方法，第一次使得不同实验室之间实验结果的交换和共享成为可能。随后Richards等[25]基于10个微卫星位点和MAT位点构建了另一个酿酒酵母分型数据库，该数据库包含246个菌株：78株葡萄酒商业酵母、103株世界各地的野生酵母、34株由 Saccharomyces genome resequencing project(SGRP)测序的野生酵母、31株新西兰酒厂分离的酵母。故可直接比较这34个菌株DNA序列数据与微卫星基因型之间的关系。该研究首次提出建立菌株DNA序列与微卫星基因型之间的对应关系。

表 1 常用微卫星位点信息Table 1 Characteristics and primers of hypervariable SSR loci in Saccharomyces cerevisiae

3 微卫星在酿酒酵母菌株倍性确定中的应用

Ezov等[30]从以色列和美国卡梅尔的“进化峡谷”分离得到68个野生酿酒酵母单菌落，利用19对微卫星引物进行PCR扩增，并对每个位点等位基因数目和杂合度进行计算，发现所选19个位点都具有较高的等位基因多态性，平均每株菌每个位点有5.1个等位基因。Ezov认为如果一个菌株每个位点有1～4个等位基因，这便预示着该菌株可能为多倍体，他预测68株酿酒酵母中包含有二倍体、三倍体，甚至还有四倍体。之后通过流式细胞术分析(flow cytometry analysis，FACS)，Ezov的预测得到确认，分别有21个二倍体菌株，7个三倍体和40个四倍体。Muller等[31]选择12个微卫星位点对170株临床和非临床酿酒酵母菌株进行分析，得到161种基因型，每个位点有16～42个等位基因，平均每个位点有27个等位基因。而每株菌每个位点都有1～4个等位基因，暗示这些菌株存在倍性差异。Muller预测55%的菌株是二倍体，14%为三倍体，11%为四倍体。最后，临床菌株杂合子的比例高于非临床菌株，暗示在临床环境中杂合子菌株的选择性优势。

4 微卫星在酿酒酵母亲缘关系确定方面的应用

Mercado等[32]连续两年从ZARM产区的酒厂设备和马尔贝克葡萄汁的自然发酵过程中采样，从所分离酿酒酵母中选择出28个代表菌株，连同来自法国的7株商业酵母，通过interdelta分型、mtDNA限制分析和微卫星PCR 3种方法考察它们之间的亲缘关系。3种方法结合分析，可准确区分34株酿酒酵母。研究结果显示，一些菌株其来源虽相同，但分子关系复杂，系统发生树也会随分析方法的不同存在差异；同时，根据不同的研究目的选择不同分析方法的重要性和必要性。Malgoire等[33]对来自法国医学中心的69株酿酒酵母和8个参考菌株(5株酿酒酵母，3株布拉酵母)进行亲缘关系分析，共选择5个微卫星位点，得到34个等位基因，64种电泳类型，并对其结构进行因子对应分析，结果聚为3类，类群Ⅰ只包含临床菌株，类群Ⅱ包含酿酒酵母参考菌株，类群Ⅲ则由布拉酵母参考菌株构成。他评价微卫星可揭示临床酿酒酵母菌株高度多样性，是研究酵母亲菌株缘关系的有力工具。

5 微卫星在酿酒酵母群体研究中的应用

Schuller等[27]在2001—2003年间从葡萄牙3个葡萄园分离得到1260个酿酒酵母单菌落，经过mtDNA-RFLP初步分型，得到361个不同类群，随后对其6个高多态微卫星位点进行分析，共得到93个等位基因，其中52个首次被报道。假设所选位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，经计算，6个位点杂合度观测值(observed heterozygosity，Ho)均低于期望值(expected heterozygosity，He)3～4倍，暗示供试群体的无性繁殖及子结构化。此外，3个葡萄园酿酒酵母群体间的遗传差异表现为等位基因频率的不同。该研究第一次使用微卫星分型技术对大量本土酿酒酵母菌株进行生态研究，为酿酒酵母菌株生态学和生物地理学研究奠定基础，也为生物多样性和遗传资源的保护提供依据。Pereira等[34]曾累计4a(2001—2003年， 2006年)从5个产区(Estremadura、Palmela、 Alentejo、Vinho Verde、Bairrada)20个葡萄园和9个葡萄品种分离得到4470个酿酒酵母菌株单菌落。通过mtDNA-RFLP和interdelta-PCR结合分析后得到502个类群，从每个类群各选择一株酿酒酵母作为代表菌株，进行10个位点的微卫星PCR，得到192个等位基因，计算亚群间(这里指来自不同产区的类群)的遗传分化程度指标(Fst)和等位基因频率相似矩阵，并基于此构建不同亚群的系统树。结果显示，酿酒酵母群体的遗传差异主要来自特定葡萄园特异等位基因的差异及10个位点等位基因频率微小差异的积累，这些差异可用于鉴定群体结构；4个年份中，同一个葡萄园均分离出相同或类似的酿酒酵母菌株，暗示每个葡萄园都有其不同于其他葡萄园的酵母群体，且特异性本土酵母的出现可能与风土有关。

工业生产中形形色色的发酵产品背后隐藏着酿酒酵母菌株迷人的遗传多样性，保护酵母多样性的核心内容就是保护酵母的遗传多样性。微卫星技术可揭示菌株地理起源和遗传特征之间的关系、两两菌株之间的关系及酿酒酵母群体之间的关系，是分析酿酒酵母多样性的有力工具。随着微卫星序列搜索技术、引物开发技术和检测分析技术的不断完善，微卫星标记将会在酿酒酵母研究中表现出更强的生命力，为本土酿酒酵母菌株遗传多样性的保护和开发提供更大便利，为酿酒酵母群体生态学研究开拓更多视角。

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