斜纹夜蛾核型多角体病毒DNA解旋酶序列比较分析

刘艳荷， 方继朝

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014;2.广东海洋大学农学院，广东 湛江 524088)

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)隶属于杆状病毒科(Baculoviridae)，α 杆状病毒属 Alphabaculovirus［1］。SpltNPV在自然界存在多种分离株，具有丰富的基因型多态性。根据宿主范围、生长特性、多角体蛋白质(Polyhedrin，polh)和DNA限制性酶切图谱，Splt－NPV分为4组:AcNPV(Autographa californica NPV)型;SpliNPV(S.littoralis NPV)型:包括 SpliNPV－A和 SpliNPV－B;SpltNPV 特有基因型［2］。Kamiya 等［3］从日本采集17株病毒，空斑纯化183个克隆，根据基因组DNA限制性酶切图谱，分为A、B和C 3种基因型，A 型与 SliNPV－D［4］或 SliNPV－B［5］相似，B型与中国、日本、菲律宾的斜纹夜蛾幼虫中鉴定的SpltNPV 相似［6－8］，而C 型SpltNPV 与A 型和 B 型都不同，是一种新型病毒。

DNA解旋酶(Helicase)是生物生命现象中的一种重要的酶，催化dsDNA向ssDNA的转换，并参与新生链的合成，在DNA修复和重组过程中都发挥着必不可少的作用。杆状病毒DNA解旋酶除了参与DNA复制外，在决定杆状病毒宿主域方面有着重要的作用［9］。AcNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV，BmNPV)的 DNA解旋酶基因(helicase)是决定它们寄主范围的重要基因［10－12］。克隆 AcNPV helicase，与 BmNPV 基因组DNA共转染家蚕细胞，筛选出既能感染所有Ac－NPV寄主，又可以在家蚕中表达的杂交病毒，其helicase基因首(1～780 bp)尾(2 795～3 669 bp)与BmNPV对应的DNA序列相同，但中间编码的22个氨基酸与AcNPV相同［13］。本研究克隆Splt－NPV不同基因型克隆的helicase，对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比较分析，为探讨杆状病毒宿主域扩大机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验用病毒A6分离自SpltNPV埃及株，X8、X15和X17从来源于日本小笠原岛的感病斜纹夜蛾幼虫中分离获得，保存在江苏省农业科学院植物保护研究所作物虫害研究室(下文简称本实验室)。病毒SeNPV以及克隆用大肠杆菌Escherichia coli TG1为本实验室保存;Taq酶购自 TaKaRa公司，pGEM－T easy Vector、T4 DNA连接酶均购自Promega(美国)公司;其他试剂均为国产分析纯试剂。离心机型号为Eppendorf 5417R和5810R。基因核苷酸序列测定在Invitrogen(美国)公司进行。

1.2 斜纹夜蛾的饲养

斜纹夜蛾幼虫自南京郊区甘蓝地采集，带回实验室饲养繁殖。幼虫饲养温度(27±1)℃，相对湿度60%，光周期14∶10(L∶D)。幼虫以麦胚人工饲料在玻璃缸中群体饲养，4龄后以6孔板单头饲养;蛹放置于同样的玻璃缸中，即将羽化时，移入成虫笼。成虫饲喂5%蔗糖水，以普通白纸置于笼壁供其产卵。

1.3 病毒的繁殖

通过幼虫口服接种繁殖病毒。将人工饲料切成小块放入6孔板，滴加适量浓度病毒，每孔接入2～3头4龄初期斜纹夜蛾幼虫，待其吃完病毒液饲料后再补充新鲜人工饲料。接毒幼虫饲养条件为:饲养温度(27±1)℃，相对湿度60%，光周期14∶10(L∶D)。幼虫发病后收集染病虫体，4℃保存备用。

1.4 病毒基因组DNA的提取

将收集的病虫研磨，纱布过滤移除虫体碎屑。差速离心500 r/min 5 min，3 000 r/min 5 min，进行多角体纯化。将纯化的多角体(POBs)109个悬浮于300 μl ddH2O，加入 100 μl 3 × DAS 碱裂解液(0.3 mol/L Na2CO3，0.5 mol/L NaCl，0.03 mol/L EDTA，pH 10.5)，37℃水浴10 min。待裂解液变清后，加入 200 μl TE(pH 8.0)，8 000 r/min离心 8 min。移出上清，加入蛋白酶K至终浓度200 μg/ml，45～50℃水浴2.5 h，再加入10%SDS至终浓度1%，继续水浴30 min。苯酚抽提1次，苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)抽提2次，再用无水乙醇沉淀基因组 DNA，干燥后溶解于 TE(pH 8.0)备用［14～16］。

1.5 PCR扩增及扩增产物的克隆

参照 GenBank登录的 SpltNPV(AF527603)、SpltNPV2(NC_011616)基因组全序列设计引物(表1)，以方法1.4提取的病毒基因组DNA为模板，PCR扩增，将所得片段克隆入pGEM－T easy Vector，测序拼接。

表1 试验中所用的PCR引物Table 1 PCR primers used in the experiments

1.6 核苷酸及氨基酸序列的比较

将所得的病毒helicase核苷酸序列和氨基酸序列与SpltNPV不同基因型及其他核型多角体病毒的helicase序列，利用Blast、Clustal W等软件进行同源性比较和分子进化分析。

2 结果与分析

2.1 SpltNPV不同基因型helicase的克隆

SpltNPV 3种基因型，A型和B型同源性较高，而C基因型与A型和B型的同源性较低，因此需要以SpltNPV和SpltNPV2基因组全序列为模板分别设计引物。SpltNPV helicase长3 708 bp，编码1 235个氨基酸;SpltNPV2 helicase长3 654 bp，编码1 217个氨基酸，为方便PCR扩增，设计2对引物。利用这些引物，分别以A6、X8、X15和X17病毒基因组DNA为模板，PCR扩增出8条1 800 bp左右的片段，克隆到pGEM－T easy Vector中测序(图1)。进行序列拼接后，得到 A6、X8、X15和 X174个病毒克隆 helicase的完整编码区。

图1 斜纹夜蛾核型多角体病毒A6、X8、X15和 X17株helicase PCR扩增产物Fig.1 Electrophoresis of helicase PCR products from SpltNPV A6，X8，X15，and X17isolates

2.2 SpltNPV不同基因型helicase的序列比较分析

SpltNPV 病毒克隆 A6、X8、X15的 helicase编码区全长相同，为3 756 bp，比SpltNPV helicase长48 bp，分别在302～316 nt、333～360 nt和2 599～2 604 nt插入15 bp、27 bp 和 6 bp。SpltNPV helicase与 A6、X8、X15的helicase核苷酸序列相似性分别为89%、89%和91%，而A6和X8与X15的相似性都是97%，A6和 X8的相似性为99%。A6、X8和 X15的 helicase氨基酸序列全长1 251个氨基酸，比SpltNPV helicase长16个氨基酸，分别在95～104个氨基酸、117～121个氨基酸和837～838个氨基酸处插入9个、5个和2个氨基酸。A6、X8和 X15的 helicase与SpltNPV helicase氨基酸序列相似性均为93%，A6和X8与X15氨基酸序列相似性均为99%。

SpltNPV病毒克隆X17的helicase编码区全长3 699 bp，比 SpltNPV2 helicase 长 45 bp，分别在2 167～2 178 nt、2 345～2 374 nt和2 483～2 485 nt处插入12 bp、30 bp和3 bp，核苷酸序列的相似性为90%。X17helicase比SeNPV helicase长30 bp，在26～28 nt和2 491～2 493 nt处各缺失 3 bp，而在2 157 ～2 159 nt、2 172 ～ 2 186 nt、2 353 ～2 364 nt、2 389 ～2 391 nt、2 440 ～2 442 nt处分别插入 3 bp、15 bp、12 bp、3 bp 和 3 bp，核苷酸序列的相似性为82%。X17helicase全长1 232个氨基酸，比SpltNPV2－helicase长15个氨基酸，在720～723个氨基酸、784～793个氨基酸和813个氨基酸处分别插入4个氨基酸、10个氨基酸和1个氨基酸，氨基酸序列相似性为92%。X17－helicase比 SeNPV－helicase多编码10个氨基酸，在第8个氨基酸、812～813个氨基酸和827～830个氨基酸处分别缺失1个氨基酸、2个氨基酸和4个氨基酸，而在725～730个氨基酸、837～847个氨基酸处分别插入6个氨基酸、11个氨基酸，氨基酸序列相似性为83%。

A6、X8、X15的 helicase 和 X17的 helicase 同源性低，核苷酸序列相似性均为52%，氨基酸序列的相似性均为42%。

2.3 SpltNPV－helicase的进化分析

从GenBank下载33种NPV的helicase氨基酸序列(表2)，利用 Clustal W 和 Treeview(V.1.6.6)软件，绘制SpltNPV不同基因型及克隆和下载的33种NPV的系统进化树(图2)。在进化树上SpltNPV不同基因型及克隆分别处于两大分枝上:X17、Splt－NPV2、SeNPV和SfMNP处在一个分支;因SpliNPV的helicase序列在GenBank上没有登录，SpltMNP与分离自日本小笠原株的X8和X15、分离自埃及株的A6及LsNPV处在一个分支上，这与多角体蛋白质基因核苷酸序列的进化分析结果基本一致［17］。本试验克隆的A6和X8同源性高，在一个小的分支上，然后和X15汇合一个较大的分支，再与SpltNPV汇合在一起，最后与LsNPV构成一个较大的分支。

图2 SpltNPV 6种基因型及克隆和33种杆状病毒helicase氨基酸序列的NJ进化树Fig.2 The NJ phylogenetic tree of 6 SpltMNPV genotypes and 33 nucleopolyhedrovirus based on helicase amino acid sequences

表2 进化分析中所用SpltNPV不同基因型和其他33种NPV的helicase基因Table 2 Helicase genes of SpltMNPV genotypes and other 33 NPVs used in the phylogenetic analysis

3 讨论

本研究克隆了 4株(A6、X8、X15和 X17)病毒的helicase基因，从同源性分析结果看，A6、X8、X15与SpltNPV同源性较高，核苷酸序列的相似性分别为89%、91%和89%，氨基酸序列的相似性都是99%。因为SpliNPV的helicase基因在GenBank上没有登录，无法进行同源性比较，因此单就helicase序列，无法判断A6、X8、X15属于 SpliNPV型(A基因型)或SpltNPV型(B基因型)。X17与SpltNPV2、SeNPV同源性较高，核苷酸序列的相似性分别为90%和82%，氨基酸序列的相似性分别为92%和83%，而与SpltNPV同源性较低，核苷酸序列的相似性为52%，氨基酸序列的相似性为42%，因此X17属于SeNPV型(C基因型)。从进化分析结果看，A6、X8和X15在同一大的分支，而X17与SpltNPV2和SeNPV在同一大的分支，这与以多角体蛋白质基因核苷酸序列的进化分析结果一致。在克隆的4株病毒helicase基因中，A6、X8、X15之间序列差异比较小，可能由于克隆的病毒株数较少，没有包括与SpltNPV亲缘关系最近的病毒株，也可能在自然界中，SpltNPV和SpliNPV发生同源重组，使得该基因逐渐趋于相似，如这两种基因型的几丁质酶基因、核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均为99%［18］。

SpltNPV2基因组全序列已被测定(NC_011616)，全长148 634 bp，150 bp以上的 ORFs 149个，基因组比SpltNPV长9 kb，多9个ORFs，两者之间96个ORFs有同源性，氨基酸序列相似性平均为44.6%，基因顺序存在很大差异。SpltNPV2比SeNPV基因组长13 kb，但两个病毒间133个ORFs具有同源性，氨基酸序列相似性平均76.5%，而且基因顺序存在明显一致性。虽然SpltNPV2与SpltNPV来源于相同的宿主。但是它们之间的同源性远不如SpltNPV2和 SeNPV 高［19］。X17是从日本小笠原采集的病毒株分离获得，已对其部分基因进行了克隆，发现其基因与SpltNPV2和SeNPV同源性高［17］。本试验以X17和SeNPV饲喂甜菜夜蛾幼虫，发现该病毒对甜菜夜蛾的感染率为44%，但甜菜夜蛾幼虫致死时间与感染斜纹夜蛾致死时间相当，远远长于SeNPV感染甜菜夜蛾的致死时间。另外也有报道SpltNPV能够侵染甜菜夜蛾的细胞核幼虫［20］。目前已证实DNA helicase是决定AcNPV和BmNPV宿主范围的重要基因，但不同杆状病毒之间，其宿主域决定机制不同。至于在SpltNPV中，helicase基因是否与病毒宿主域或侵染时间有关，还需要进行基因删除等试验进一步研究确定。

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