原位分离耦合技术制备生物丁醇的研究进展

朱大伟，韦 萍，吴 昊，孙梦茹，姜 岷

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，南京211800；2.苏州大学附属第三医院，常州213003）

原位分离耦合技术制备生物丁醇的研究进展

朱大伟1，2，韦 萍1，吴 昊1，孙梦茹2，姜 岷1

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，南京211800；2.苏州大学附属第三医院，常州213003）

笔者对吸附法、液液萃取法、气提法、渗透汽化法等提取技术原位分离耦合丁醇进行了综述，并对其分离特性与效果进行了比较。针对目前原位分离耦合发酵制备生物丁醇的应用现状和面临的挑战，并结合本课题组已取得的成果，对原位分离耦合发酵制备生物丁醇的前景进行了展望。

生物丁醇；发酵；原位分离；耦合

近年来，丁醇作为一种新型燃料受到各国广泛重视，与乙醇相比，其具有热值高、使用安全、易于管道运输、无需改造发动机等优点［1］。联合国国际能源署已将生物丁醇列为第二代生物燃料，目前BP、杜邦等能源化工巨头也纷纷涉足丁醇燃料开发领域［2］。在20世纪40年代，这种以丁醇生产菌株在厌氧条件下利用多种糖类发酵联产丁醇、丙酮及乙醇的工艺简称AB或丙酮-丁酮-乙醇（ABE）发酵，是生产丁醇的主要方法，发展成为仅次于酒精发酵的第二大发酵产业［3-4］，但20世纪50年代以后逐渐被石化法取代。进入21世纪，随着国际原油价格持续上涨，生物法具有不依赖石油、条件温和等优点，使得生物法制备丁醇再次成为全球研究与应用的热点。

产物抑制是生物丁醇制备研究中迫切需要解决的技术难题，当丁醇质量浓度为5 g／L时，即可对菌株产生抑制作用；当丁醇质量浓度大于13 g／L，菌株的生长与代谢被完全抑制［4］。而酿酒酵母对乙醇的耐受度可达90 g／L以上，严重的产物抑制导致丁醇浓度极低（丁醇质量分数≤1.5%，在生物乙醇的制备中，乙醇质量浓度大于100 g／L），生产效率低下，蒸馏提取能耗极高，削弱了生物法的竞争力。解决该问题可采取2种手段［4］：①利用诱变、基因工程手段改造菌种使其能耐受丁醇；②采用原位分离技术，将ABE溶剂在发酵过程中移走以减少其对细胞的毒害。目前，通过菌种改造，丁醇的质量浓度可达17～21 g／L［4-5］，但并不能显著降低后期蒸馏能耗，Qureshi等［4］指出：将分离技术原位集成于丁醇发酵，是降低分离成本最根本的手段。

分离耦合与生物反应过程的研究兴起于20世纪70年代末，当时的研究主要针对可挥发性初级代谢产物，如生物法生产的乙醇，主要采用基于产物挥发性的分离方法进行产物的在线分离。近年来，随着耦合技术的日趋成熟，形式也更趋多样化［6］，自20世纪90年代以来，吸附法［7-8］、液液萃取法［9-10］、气提法［11-13］、渗透汽化法［14-20］提取技术已开始应用于丁醇的原位分离研究中，并取得了诸多成果。

1 生物丁醇反应分离耦合技术研究进展

1.1 吸附法原位分离丁醇

采用吸附法分离丙酮-丁醇发酵产物，主要是利用吸附剂对有机溶剂的选择性吸附以消除产物抑制，其吸附剂包括硅藻土、沸石分子筛、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyridine，PVP）和聚合树脂［7-8，21］。

Yang等［22-23］以PVP为吸附剂，与不同丁醇发酵方式（分批发酵、补料分批发酵、重复补料分批发酵）耦合，相比于分批发酵，吸附-分批发酵耦合工艺的ABE生产速率提高了130%，将补料分批发酵与吸附耦合，消耗糖190 g，ABE生产速率达到1.33 g／（L·h），提高了232%，将重复补料分批发酵与吸附耦合，消耗糖1 198.5 g，ABE生产速率进一步增加至1.69 g／（L·h）。Nielser等［8］从一系列商业聚合树脂中筛选出聚苯乙烯类树脂Dowex®Optipore SD-2与C．acetobutylicum ATCC 824发酵耦合，发现在初始葡萄糖80 g／L的发酵液中分别加入0.025和0.05 kg／L的树脂，丁醇产率与未加树脂的发酵液相比分别增加了53%和83%。由此可见，发酵-吸附耦合工艺对ABE发酵过程中产量和产率的提高以及提高糖利用率有较明显的作用。由于溶剂和吸附剂之间存在的相互作用以及吸附平衡，这些通常是非线性的，因此过程设计与发酵控制比较复杂。

1.2 液液萃取法原位分离丁醇

液液萃取-发酵分离耦合的原理主要是利用非水溶性有机萃取剂与发酵液混合，因为ABE在萃取剂中的溶解度比在发酵液中的溶解度要大，从而实现ABE在有机相中被选择性地分离浓缩，却不需要移除底物［24-26］，以达到提高溶剂生产速率、产量及糖的利用率。

目前，研究较多的萃取剂有油醇［25-26］、苯甲酸苄酯［25］、邻苯二甲酸二丁酯［25］、生物柴油［27-28］等，也有使用正庚醇、乙酸乙酯、聚丙烯醇、橄榄油、反-2-乙基-2-己醛［29］和表面活性剂［10］的研究报道。

Qureshi等［25］利用油醇萃取与C．acetobutylicum连续发酵体系耦合，当稀释率为从0.35提高至1.10 h-1时，ABE生产速率从3.1升至4.0 g／（L·h），溶剂产率达到0.35 g／g，但油醇是一种昂贵的溶剂。Bankar等［9］利用油醇和癸醇的混合物作为萃取剂，与C.acetobutylicum B 5313连续发酵体系耦合，ABE产量由15.98 g／L提高到25.32 g／L，溶剂生产速率为2.5 g／（L·h），产量为0.35 g／g，在稀释率为0.05 h-1时，糖的利用率达到83.21%，而无耦合体系的糖利用率只有54.38%。生物柴油虽然对菌体的生长具有轻微的毒害作用，但其价格相对低廉。因此，以生物柴油萃取丁醇得到的混合溶剂可直接作为燃料来替代普通柴油使用，从而完全省去产品的回收精制过程，节约能耗，提高丁醇发酵的经济性。Ishizaki等［27］研究了以棕榈油制备的生物柴油为萃取剂构建的发酵萃取耦合体系，耦合后的葡萄糖利用率由62%增至83%，ABE质量浓度及产率分别从21.2 g／L和0.38 g／g提高到29.8 g／L和0.40 g／g。胡翠英等［28］对4种不同生物柴油（原料分别为地沟油、菜籽油、棕榈油和废煎炸油）耦合丁醇发酵，结果发现丁醇的生产强度最高可以达到0.213 g／（L·h），比传统发酵提高了10.9%。Dhamole等［10］利用表面活性剂（Triton X 114、L64、L62LF、L61和L62）与C．pasteurianum发酵体系耦合，发现体积分数6%的L62可使丁醇产量从5 g／L提高到30 g／L，通过在120～130℃下蒸发，95%的乙醇可从表面活性剂相中被回收。

综上，液液法萃取-发酵耦合可削弱产物ABE对体系的抑制，达到提高产量的目的，同时也可浓缩ABE的浓度。不过，由于萃取剂价格昂贵且易流失或部分萃取剂对菌体具有一定的毒害作用，其应用受到了限制。

1.3 气提法原位分离丁醇

气提是一个物理过程，它采用一个气体介质破坏原气液两相平衡而建立一种新的气液平衡状态，使溶液中的某一组分由于分压降低而解吸出来，从而达到分离物质的目的。通过控制气提介质的量可以控制气提程度。当气泡在发酵罐中产生或者发生破碎时，周边的液体随之振动，有利于料液中挥发性物质的逸出，随后挥发性物质在冷凝器中被凝结收集而实现分离［30］。

气提可与多种丁醇发酵过程相耦合，如分批发酵、连续发酵等，其原理主要是利用气体在发酵液中产生气泡，由气泡携带ABE，随后逸出并在冷凝器中收集，然后气体经过回收重新进入发酵罐移出更多的溶剂。目前，可以使用的载气有N2和丁醇发酵中的自产气体（H2和CO2）。Ezeji等［31］采用气提与C．beijerinckii BA101分批发酵耦合，与分批发酵相比较，葡萄糖消耗量由45.4 g／L提高到500.1 g／L。Qureshi等［32］用C．acetobutylicum以玉米纤维木聚糖作为原料发酵生产ABE，将底物水解、发酵、气提回收等过程耦合，ABE的产量及产率比传统发酵过程有所提高，且ABE的分离因子达到12.12。Ezeji等［33］以玉米淀粉为发酵原料，分别将气提与分批发酵和流加发酵进行耦合，分批发酵与气提相耦合后，料液中糖利用率由74%提高到92%；与连续发酵体系耦合后，ABE质量浓度由18.6 g／L提高到81.3 g／L。de Vrije等［11］用C．beijerinckii以葡萄糖／木糖（质量比2∶1）为底物产ABE，采用气提耦合连续发酵，稀释率为0.06 h-1时，总糖消耗量由33.4 g／L提高到52.1g／L，ABE生产速率由0.56 g／（L·h）增加至0.93 g／（L·h）。Xue等［12］采用两步气提与纤维填充床反应器发酵产ABE过程耦合，丁醇产率由0.2 g／g提高至0.25 g／g，生产速率由0.3 g／（L·h）增加至0.4 g／（L·h），第一步气提获得的溶剂中的丁醇质量浓度为175.6 g／L（ABE质量浓度为227.0 g／L），将其进行第二步气提后，丁醇质量浓度增加到420.3 g／L（ABE质量浓度达532.3 g／L）。Lu等［13］采用以木质纸浆水解物为底物生产丁醇，采用气提耦合后，丁醇质量浓度达13.46 g／L，提高了47.2%。

综上可见，气提应用于发酵-分离耦合体系不但可以避免丁醇的产物抑制作用，显著提高ABE的产量及生产速率，还可实现ABE溶剂的富集，降低后续的分离工艺成本。

1.4 渗透汽化膜原位分离丁醇

渗透汽化（pervaporation）是一种利用液体混合物中不同组分在膜中的溶解和扩散性能的不同，有选择性地在膜内汽化透过并被冷凝回收的新型膜分离技术，目前有机物脱水的水优先透过膜已进入工业化实用阶段［34］。有机物优先透过膜是利用极性低、表面能小的橡胶态聚合物制备的疏水性膜，可分离水中少量或微量挥发组分或有机组分，将该技术与产溶剂发酵过程耦合，可解除产物抑制、提高发酵产率，同时实现对产物的浓缩，显著降低后续能耗，已成功应用于乙醇耦合发酵研究［35］。

1.4.1 丁醇分离膜材料的开发

采用渗透汽化技术制备燃料丁醇的关键问题之一是开发和制备高性能（高的渗透通量和选择性）的渗透汽化膜。根据膜材料性质和用途的不同，渗透汽化膜可以分为疏水膜和亲水膜。目前，已有报道的用于耦合发酵制备丁醇的渗透汽化膜主要有：聚二甲基硅氧烷（poly dimethylsiloxane，PDMS）及其共聚、改性和掺杂膜［36-38］、液膜（liquid membrane）［39］、聚三甲基硅丙炔膜（poly［⁃1⁃（trimethylsilyl）⁃1⁃propyne］，PTMSP）［40］、聚醚酰胺嵌段共聚物膜（poly（ether block amide），PEBA）［16］、聚丙烯膜（PP）［41］、聚四氟乙烯膜（PTFE）［42］等，其对丁醇的分离性能见表1。由于PTMSP膜材料本身存在稳定性差的问题，而PEBA膜、PP膜和PTFE膜对丁醇的选择性都比较低，性能稳定并具有工业化前景的为PDMS膜，但是存在的问题仍然是膜的选择性或分离通量较低。另外在多孔的支撑体上制备超薄无缺陷的PDMS膜层是研究者们追求的目的。Liu等［43］开发的PDMS -陶瓷复合膜，在30℃下，10 g／L丁醇-水溶液中，分离因子可达26，通量为457 g／（m2·h）。在发酵温度下（37℃）具有良好的有机物透过性能与极高的渗透通量。在低膜面循环流速下（15 L／h），对ABE真实发酵液中丁醇的分离因子为13.99，总渗透通量为840 g／（m2·h），是相关文献报道的数倍，适用于从丁醇发酵液中直接提取溶剂［17］。

表1 不同渗透汽化膜的耦合分离性能Table 1 Pervaporation performance of differentmembranes integrated w ith fermentation broth

1.4.2 渗透汽化原位分离耦合制备丁醇的应用

目前，关于利用渗透汽化分离提取丁醇已有文献报道，但多以水相模型体系或已失活的丁醇发酵液为分离对象，将渗透汽化膜分离与丁醇发酵过程耦合仅有少量报道，如Geng等［44］将PDMS材质的渗透汽化膜与丁醇的分批及补料分批发酵相耦合，丁醇及丙酮被有效移出，葡萄糖消耗速率显著提高。Qureshi等［36］将渗透汽化与Clostridium beijerinckii BA101分批发酵相耦合，ABE生产速率达到0.69 g／（L·h），比分批发酵提高97%。Qureshi等［37］将渗透汽化分离与补料分批发酵耦合，补料葡萄糖浓度达到500 g／L，渗透液中的ABE质量浓度达到165.1 g／L，ABE产率从0.35 g／（L·h）提高到0.98 g／（L·h）。Yen等［16］研究发现，PEBA膜耦合分批发酵比不耦合发酵产量提高了43%，持续24 h补料发酵的丁醇产量也比未耦合发酵提高了39%。van Hecke等［20］将PDMS材质的渗透汽化膜与C.acetobutylicum ATCC 824补料发酵相耦合，ABE产率从0.45 g／（L·h）提高到0.88 g／（L·h），发酵耦合持续200 h，渗透液中总溶剂质量浓度达202 g／L。Setlhaku等［45］将PDMS材质的渗透汽化膜与气提法应用在C．acetobutylicum ATCC 824发酵中两步法生产丁醇，37℃时，渗透液中丁醇质量浓度为167 g／L，ABE质量浓度为269 g／L。但以上研究中使用的渗透汽化膜在发酵温度下（37℃）的渗透通量均低于100 g／（m2·h），单位膜面积的处理能力较低。笔者所在课题组的Wu等［17］将高通量PDMS／陶瓷复合膜用于渗透汽化分离丁醇，该膜在37℃下与丁醇补料分批发酵耦合200 h，与分批发酵相比，总溶剂生产速率提高了23%，61%的溶剂被移出体系，渗透液中ABE质量浓度达96.2 g／L达到文献报道水平，但平均膜渗透通量达494 g／（m2·h），远高于文献报道，处理相同体积丁醇发酵液的膜面积仅为文献报道的1／10～1／30。而Chen等［18］比较渗透汽化连续耦合与间歇耦合发酵生产丁醇的效率，结果表明渗透汽化连续耦合发酵具有更高的生产效率。

2 各类生物丁醇制备原位分离技术性能比较与挑战

2.1 不同原位分离技术制备生物丁醇性能的比较

目前，吸附法、液液萃取法、气提法、渗透汽化法等低能耗的提取技术已开始应用于丁醇的反应分离耦合研究中，但各有优缺点，总结如下：

吸附法具有操作简单的优势，但吸附剂对丁醇的吸附容量仅为48～252 mg／g［7］，还会吸附乙酸、丁酸等中间产物及蛋白等生物大分子［8，21-23，46］。此外，在发酵体系中，吸附剂不能进行原位解吸再生。因此，为了避免过早出现吸附饱和，往往需要加入大量的吸附剂以控制丁醇浓度，而吸附剂多为多孔介质，很容易被发酵液污染，造成吸附剂失效。Chen等［47］通过增加微滤膜除去菌体，减少了树脂污染，实现了吸附-发酵耦合过程的长期运行，但这种方式增加了操作的复杂性。

液液萃取法可以根据两相不相溶的原理分离出疏水性强的产物，但是对具有高选择性的萃取剂ABE溶剂的细胞具有毒害作用，低毒性的液体萃取剂对产物的选择性通常很低或极其昂贵［26，28］。Qureshi等［48］比较了直接液液萃取与膜萃取与ABE发酵过程耦合的区别，在液液萃取过程中，油醇对细胞的直接接触不但产生毒害作用，还将会萃取发酵中间产物（如丁酸等），降低了发酵产率；在膜萃取过程中，虽然中间产物的流失问题可以有效解决，但萃取剂的毒性问题仍然不可避免地存在。此外，丁醇的回收与萃取剂的再生往往需要通过精馏，也会显著增加回收能耗。

气提耦合发酵对培养基无害，也不会移出营养物质和中间产物，不需要昂贵的萃取剂，但气提-发酵耦合工艺的性能受到发酵的操作方式、气泡大小、载气速率、消泡剂等众多因素的影响［30］。气提法的载气有N2和丁醇发酵中自产的气体（H2和CO2）。由于丁醇发酵是在严格的厌氧条件下进行的，所以需要先通入不含O2的N2作为保护气，直到发酵产生H2和CO2才关闭N2通道，操作方式变得繁琐，不利于工艺的简化［31］。气泡直径的大小会影响气提的效率，气泡越小，气液传质面积越大。气泡的尺寸会显著地影响发酵罐中的质量传递和混合动力学。Ezeji等［30］在对C．beijerinckii发酵的研究中，用小尺寸气泡（＜0.5 mm）来进行气提，在反应器里易产生大量气泡，需要使用消泡剂，致使生产效率由0.47 g／（L·h）降至0.25 g／（L·h），这也证明消泡剂导致的气泡变化对发酵有负面作用。气提速率与气体回收率速率成正比，但载气速率的控制需要消耗额外的能量。

渗透汽化法是通过橡胶态聚合物制备的疏水性膜，选择分离水中少量或微量有机溶剂，而营养物质、细胞被截留，它具有选择性好、清洁无污染、分离条件温和等优点。该技术与产溶剂发酵过程耦合，可解除产物抑制、提高发酵产率，同时实现对产物的浓缩，显著降低后续能耗。此外，渗透汽化膜对细胞具有良好的生物相容性，可直接与发酵液接触。Qureshi等［36］采用该耦合技术连续发酵90 h，发现对菌株无消极影响，Wu等［17］采用PDMS／陶瓷复合膜连续耦合发酵200 h，Chen等［18］采用PDMS膜连续耦合发酵300 h，均未发现分离膜对菌株产生不利影响。Qureshi等［48］将液液萃取法、膜萃取法、气提法和渗透汽化法分别与ABE发酵过程耦合，比较了4种分离耦合技术对溶剂产率和生产效率的影响，他们指出：气提法和渗透汽化法是与ABE发酵最有前景的耦合分离技术。

2.2 渗透汽化膜应用于丁醇发酵耦合体系所面临的挑战

1）如何在反应器-渗透汽化原位分离耦合系统中避免游离细胞对膜的污染。渗透汽化膜的分离性能通常采用两个参数来衡量：分离因子和渗透通量。Qureshi等［48］发现：将PDMS膜与丁醇发酵直接耦合，与分离失活的丁醇发酵液相比［49］，该膜对丁醇的分离选择性降低了65%，渗透通量减少31%，推测膜被含有活细胞的发酵液污染。Liu等［19］在原位分离耦合研究中发现，渗透汽化膜的通量降低了50%，对ABE的分离选择性降低了24%，SEM观察显示膜表面附着了大量活细胞。可见，游离细胞在膜表面的积聚使渗透汽化膜分离性能迅速下降，而丁醇移出速率的降低会造成丁醇的逐渐积累，在耦合后期出现产物抑制现象，丁醇产生的抑制作用会诱发细胞自溶分解［50］，加剧膜污染。Fadeev等［40］指出ABE发酵液中极低浓度的硬脂酸盐或软脂酸盐（0.5 mmol／L，由自溶的细胞膜释放）即可造成PTMSP膜通量及分离选择性损失10倍。

为了解决膜污染问题，Qureshi等［38］采用超滤预先将丁醇发酵液中细胞分离，可保持渗透汽化膜分离的稳定性，但这类手段涉及不同膜系统之间处理能力的匹配。Wu等［17］对污染的渗透汽化膜采用离线清洗，虽然可恢复分离性能，将体系中的丁醇浓度控制在临界浓度以下，但频繁更换膜组件增加了操作难度，容易破坏体系的厌氧环境。因此，原位分离过程中保持渗透汽化膜分离选择性与渗透通量的稳定是实现高效合成丁醇的关键因素。

2）如何在反应器-渗透汽化原位分离耦合系统中长期保持细胞的转化活力。已有的研究发现：在渗透汽化膜原位分离耦合补料分批发酵过程中，截留细胞合成丁醇的速率逐渐降低，至第3批时，溶剂生产速率已降低23%，发酵周期显著延长［38］。Ennis等［51］指出：生物合成丁醇过程中，菌体活力下降会导致细胞死亡和孢子形成，溶剂产量减少，使连续培养过程中丁醇生产效率下降。酸性环境可诱导产丁醇菌株将有机酸转化为溶剂（pH＜4.8）［3］，但发酵体系中未解离的丁酸会破坏细胞的pH跨膜梯度，抑制菌株的生长与代谢。当未解离的丁酸质量浓度为0.5 g／L时，即能完全抑制产丁醇菌株的生长［52］。Chen等［18］研究发现渗透汽化膜对有机酸截留率高，在长期耦合运行过程中，体系多维持在pH 4.5，此时66%的丁酸未发生解离，导致菌体衰亡，生产速率逐渐降低。而Chen等［47］发现固定化可明显提高细胞对丁醇的耐受性。由此可见，保持原位分离耦合体系中细胞的转化活力是实现生物丁醇高效连续制备的关键技术。

3 结论和展望

目前的研究表明，将原位分离技术用于发酵制备生物丁醇具有高效、节能和环保的优势，有利于降低其制备成本，但各种分离手段的分离选择性与效率仍需进一步提高，同时还存在耦合系统稳定性的问题。因此，在今后的研究中，不应局限于单一分离技术与丁醇发酵过程的耦合，应更加注重于分离技术的设计与过程的优化和集成。在许多情况下，仅依赖于单一分离系统并非最佳的选择，而要从产品工程的角度出发，将分离过程和体系的其他过程集成（如丁醇高抗逆性菌株的选育、发酵过程的调控、新型反应器的应用等），则可以充分发挥这些技术的优势，形成相关的控制策略，使ABE溶剂的生成与移出速率相匹配，并保持产物分离性能与细胞转化活力的长期稳定，实现生物丁醇的高效连续制备。

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Progress in separation technologies integrated w ith fermentation for bio⁃butanol recovery

ZHU Dawei1，2，WEIPing1，WU Hao1，SUN Mengru2，JIANGMin1

（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211800，China；2.The Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou 213003，China）

Recent years，adsorption，gas stripping，liquid⁃liquid extraction，and pervaporation technologies had integrated with fermentation for butanol，ofwhich，pervaporation，as a promisingmembrane separation technology，had advantages of in⁃situ recovery of bio⁃butanol.In the integrated process，the inhibition of butanol on themicroorganism activity could be reduced by pervaporation，and butanolwas concentrated on permeates.The pervaporation technology for bio⁃butanol production was reviewed in detail membrane materials，integrated processes，the recent applications，and challenges were also disscussed.Finally the future trend in the field was prospected combined with achievements of our research team.

bio⁃butanol；fermentation；in situ recovery；pervaporation

TQ920.6

A

1672-3678（2013）06-0090-07

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.019

2013-06-17

国家自然科学基金青年基金（21106067）；江苏省高校自然科学研究重大项目（11KJA530001）；材料化学工程国家重点实验室基金

朱大伟（1982—），女，江苏连云港人，博士研究生，研究方向：生物化工；韦 萍（联系人），教授，E⁃mail：weiping＠njut.edu.cn