纳米磁珠提取法在手足口病病原RNA提取中的应用

祝俭平，廖礼梅，郑敏华，王庆元，马秋林（广东省东莞市妇幼保健院产前诊断中心 523002）

手足口病（HFMD）是由肠道病毒引起的急性传染病，引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型（EV71）和A组柯萨奇病毒（CA）、埃可病毒（Echo）的某些血清型。实时荧光反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）具有高灵敏度和高特异性，并且快速，是临床实验室诊断常用方法。周围环境中广泛存在的RNAse（RNA酶）能快速降解RNA，对核酸提取提出更高要求，提取方法越复杂，RNA降解就越多，容易造成假阴性结果。纳米磁珠法能够做到核酸提取过程自动化，减少人为RNAse污染，作者对其和传统的Trizol抽提法进行对比，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2012年5月本院手足口病高峰期，取门诊及住院临床诊断为手足口病患儿发病7d内的肛拭标本240例，患儿年龄6个月至10岁。

1.2 仪器设备 Roche LightCycler 480荧光定量PCR仪及上海之江EX2400核酸自动提取仪。

1.3 试剂来源 EV71型和柯萨奇病毒A组16型（CA16）核酸实时荧光RT－PCR检测试剂盒和Trizol提取试剂均购自中山大学达安基因股份有限公司，纳米磁珠RNA提取试剂盒购自上海之江公司。

1.4 RNA提取方法

1.4.1 纳米磁珠自动提取法 肛拭标本溶解于适量生理盐水中，振荡混匀，备用。取出一块预装板，撕开铝箔，分别加入6 μL RNA助沉剂及200μL标本于预装板对应的A1－A12孔，将预装板放入核酸自动提取仪的卡槽内，安装好磁套，选择程序“RNA Isolation”运行。运行结束后，弃磁套，于核酸自动提取仪内取出预装板，E1－E12对应孔中的液体即为提取好的RNA，可直接用于检测。

1.4.2 Trizol提取法 肛拭标本加入300μL生理盐水，振荡洗脱，洗脱液加入Trizol和氯仿，静置3min，12 000r/min离心5min；样品即分成水样层、中间层和有机层，收集水样层通过SiO2沉淀RNA来还原，离心取沉淀加入75%乙醇液洗涤，离心沉淀，自然干燥，加入30μL DEPC水混匀，待用。

1.5 实时荧光RT－PCR 检测肠道病毒EV71、CA16特异核酸片段严格按试剂说明书操作。

1.6 统计学处理 SPSS12.0软件对结果进行分析处理，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

240例临床标本提取EV71和CA16病毒核酸，纳米磁珠法检测EV71阳性率27.5%，CA16阳性率23.3%；Trizol法EV71阳性率26.6%，CA16阳性率22.1%，见表1。经SPSS 12.0统计分析，EV71和CA16两种方法检测对比阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），显示纳米磁珠提取法可以用于临床诊断实验。

表1 两种RNA提取方法对240例肛拭标本实时荧光RT－PCR检测结果［n（%）］

3 讨 论

手足口病毒属小RNA病毒科、肠病毒属，其中最常见为EV71和CA16型。柯萨奇病毒是多种疾病的致病原，不仅可以引起呼吸道感染，还可引起心肌炎、心肌病及神经系统疾病。柯萨奇病毒分为A、B两大组，A组23个型，B组6个型，能引起手足口病的主要为A组的16型，A组的4、5、9、10型及B组的5型亦可引起该病。新肠道病毒包括4个血清型（68、69、70、71），只有71型可引起手足口病［1］。EV71型常引起重型病例，造成中枢神经系统感染和心肌炎等，临床出现致死病例，迫切需要对EV71进行快速检测。临床常用检测方法为实时荧光RT－PCR，其具有高度灵敏度和高特异性，与病毒学培养结果一致［2］。核酸提取的原理主要分为3个部分：第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的载体上，当然这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类则既不亲和也不吸附；第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。现今核酸提取有各种方法，主要是针对第二部分使用特定载体的不同而区分，常见的有Trizol提取法、旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、纳米磁珠提取法等［3］。其中纳米磁珠提取法可应用于全自动核酸提取仪，提取自动化，不但大大降低提取的劳动强度，而且减少了核酸手工提取中容易出现的操作失误，增加核酸提取的一致性和重复性。

纳米磁珠法中使用的磁性微球在1996年开始出现，是将无机磁性粒子与高分子材料结合形成的一种复合微球，是新型功能材料。由于其自身兼具高分子微球和磁性粒子的众多特性，故无外增加磁场时在溶液中分散均匀、稳定；增加外磁场则可简单快速分离，可以通过共聚、表面改性赋予其表面多种反应性功能基团，具有良好的生物相容性，使传统繁重的核酸提取过程变为自动化［4］。目前大多数全自动核酸提取仪都是采用硅吸附法，把二氧化硅等成分吸附到磁珠表面对RNA进行提取。本文对纳米磁珠法和Trizol法提取手足口病RNA病毒进行对比，结果两种方法效果接近，差异无统计学意义。EV71和CA16阳性率用纳米磁珠法测定分别为27.5%和23.3%，和广东省内其他医院基本相同［5］。

经典的Trizol提取法，提取RNA纯度高，缺点是操作较为烦锁，抽提和沉淀等操作都可能引起RNA的损失。而全自动核酸提取仪法利用磁性颗粒从样品裂解物中抓获总RNA，对总RNA的破坏较小，同时自动化核酸提取也避免了交叉污染的可能性［6］。本次实验中，纳米磁珠法有5例检出阳性，而在Trizol法中为阴性，可能是因为Trizol法核酸提取处理时间较长，操作较为烦锁，周围环境中广泛存在的RNAse（RNA酶）能快速降解RNA，造成标本假阴性结果。在处理大批量标本时，纳米磁珠法应用于自动分析仪总耗时少，提取效率高，具有明显的优势。

［1］ 倪语星，尚红.临床微生物学与检验［M］.4版.北京：人民卫生出版社，2009：436－438.

［2］ 李金明，熊德琴，齐晓彤，等.实时荧光定量PCR在手足口病病原体检测中的应用［J］.实验与检验医学，2011，29（2）：129－130.

［3］ 李金明.实时荧光PCR技术［M］.北京：人民军医出版社，2011：75－80.

［4］ 刘晓红，布和巴特尔，黄波，等.生物提取用磁性微球的制备及其性能［J］.化学工程师，2010，24（9）：64－66.

［5］ 黄建国，吴立文，骆志辉，等.手足口病肠道病毒EV71和CoxA16感染的检测分析［J］.实验与检验医学，2011，29（3）：328－330.

［6］ 傅松哲，倪贤生，夏文，等.3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较［J］.中国热带医学，2010，10（7）：783－785.