大黄中有效成分的提取、分离测定及其抗突变作用

刘蓓蓓

（青海普兰特药业有限公司，青海 西宁 810007）

大黄中有效成分的提取、分离测定及其抗突变作用

刘蓓蓓

（青海普兰特药业有限公司，青海 西宁 810007）

随着国民经济水平不断的提高，天然中草药的研究与利用成为了一种新的潮流。大黄作为一种常用中药，其有效成分的提取、分离测定以及抗突变作用引起了人们的广泛关注。为此，我们开展了对大黄有效成分提取、分离测定以及抗突变作用的研究工作。

大黄；大黄酸；大黄甲醚；大黄素

大黄作为一种常用的中药，是种非常重要的出口商品，它具有抗菌、抗病毒、利水通淋、舒肝利胆、抗肿瘤、消炎、止血、止吐等多方面的功效。近几年来，大黄作用的研究越来越多的引起了学者的关注。

1 大黄的简介

大黄是多种蓼科大黄属的多年生植物的合称，也是中药材的名称，主要有掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄和食用大黄得分别。它的主要活性成分是蒽类衍生物，主要包括大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素和土大黄素等有效成分，除此还含有许多化合物、有机化合物和无机物。

2 大黄有效成分提取的实验

2.1 实验材料

土大黄苷、蒸馏水、甲醇、乙醚、氯仿、无水硫酸钠以及十八烷基硅烷键合硅胶等。

2.2 实验仪器

三口烧瓶、回流冷凝管、LC-10A高效液相色谱仪、分子筛、烧杯、玻璃棒、试管、量筒、胶头滴管、坩埚、坩埚钳、研钵、蒸发皿、药匙、滤纸、pH试纸、分析天平、称量瓶及电热炉。

2.3 实验目的

了解以大黄为代表的中医药有效提取的基本方法，进一步掌握大黄有效成分提取、分离测定以及抗突变的作用。

2.4 实验原理

土大黄苷经过甲醇浸泡以后，大黄酚、大黄素等有机物会溶解于甲醇中，制成待测液以后，由于它们之间的相互作用是不同的，可以使用高效液相色谱法来进一步进行各种有效成分的提取、测量。

2.5 实验内容

2.5.1 鉴别

本品横切面：根木栓层以及皮层大多数已经去除。韧皮部非常明显；薄壁组织十分发达。形成层成环状。木质部射线较密，宽2～4列细胞，内含棕色物质；导管非木化，常1至数个相聚，稀疏排列。薄壁细胞含有草酸钙簇晶，并含有多数淀粉粒。根茎的髓部宽大，在其中可以常见黏液腔，内有红棕色物质；木质的部位于形成层的外方，粉末呈现黄棕色。取粉末少量，进行微量升华，我们可以看到菱状针晶或者羽状结晶。①取本品粉末0.1g，然后取甲醇20mL浸渍其中1h，过滤后，取滤液5mL，蒸干以后加水10mL使溶解。②加盐酸1mL，置于水浴上加热30min，立即冷却后，用乙醚2次提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干后，残渣加氯仿1mL使溶解，作为供试品溶液。③另外取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。④取大黄酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照溶液。⑤依据薄层色谱法实验，吸取了这三种溶液各4mL，分别点于同一种以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以30～60℃的石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，然后晾干，放置紫外光灯下检视。⑥在供试品色谱中，与对照药材色谱相对应的位置上，显示出了相同的5个橙黄色荧光主斑点；并且在和对照品色谱相应的位置上，显示相同的橙黄色荧光斑点，放置在氨蒸汽中微熏后，在日光下检视，会发现斑点变为红色。图1为分离提取的流程图。

图1 分离提取的流程图

2.5.2 检查

①取土大黄苷粉末0.2g，加甲醇2mL，温浸10min后放置直至冷却；②取上清液10mL，将其点于滤纸上，用45%乙醇展开，取出后晾干；③放置10min以后，放置紫外光灯下检查，不得显示持久的亮紫色荧光；④干燥失重，取本品不得过10%，酸不溶性灰分不得过0.8%。

值得注意的是：总灰分不得超过10.0%，酸不溶性灰分不得超过0.8%。

2.5.3 含量测定

对照品溶液的制备方法：①精确称量大黄素、大黄酚对照品各5mg，分别放置在50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；②分别精确量取大黄素溶液1mL及大黄酚溶液2mL，分别放置在25mL量瓶中，加甲醇到达刻度，均匀摇动，可以得到。

供试品溶液的制备：①取本品粉末大约0.1g，然后取本品粉末的测定水分，精确称量后放置在50mL锥形瓶中，精密加甲醇25mL，称定重量；②加热回流30min，放冷后，再称定质量，用甲醇来补足减失的重量，摇匀后，过滤，精确量取续滤5mL，放置在50mL的圆底烧瓶中，将甲醇挥发；③加浓度为2.5mol/L的硫酸溶液10mL，超声处理5min过后，加入氯仿10mL，加热回流1h，冷却后，放置在分液漏斗中，然后用少量氯仿洗涤容器，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8mL，合并氯仿液，无水硫酸钠脱水；④氯仿液放置在100mL锥形瓶中，将氯仿挥发，残渣精密加甲醇10mL，称其重量，放置于水浴中微热溶解残渣，放冷后，再称定质量；⑤用甲醇填补减少的重量，均匀摇动，过滤，取续滤液，可得。⑥吸取这两种对照品与供试品溶液各自5mL，注入液相色谱仪，测定得。

图2 纸层析图谱（1 煎煮法所得大黄溶液；2 1,8-羟基蒽醌对照溶液；3 超声法提取的溶液）

图3 大黄成分的液相色谱图（A 煎煮提取液；B 超声提取液）

2.5.4 炮制

①大黄：去除杂质，洗净，润透，切厚片或块状，晾干。②酒大黄：取净大黄片，依照酒炙法炒干。③熟大黄：取净大黄片，依照酒炖或酒蒸法炖或蒸直到内外都呈黑色。④大黄炭：取净大黄片，依照炒炭法炒，直到表面焦黑色、内部焦色。

2.5.5 测定结果

按照干燥品计算，含有大黄素和大黄酚的总量应该不会少于0.05%，通过对大黄有效成分的提取、分离测定，我们了解了大黄的物理和化学性质，并且对大黄的药理也有了新的认识。

3 大黄有效成分分离测定的主要方法

3.1 纸色谱法

我们可以用纸层法来研究蒽醌衍生物的纸上层析，但是由于纸色谱法分离效率是比较低的，所以已经逐渐被其他层析方法所替代，不是特别的常用。

3.2 柱色谱法

大黄酚和大黄素甲醚在结构上十分相似，极性上也存在许多相似的地方，所以用一般的层析方法很难分离。用柱层硅胶、石油醚作洗脱剂制备性来分离出大黄素甲醚和大黄酚，并且与纤维素柱层析进行了比较。当然也可以用硅胶H常压柱、石油醚-乙酸乙酯作洗脱剂来高效的分离出大黄素甲醚和大黄酚。

3.3 薄层色谱法

薄层色谱法是在大黄的分离中一种十分常用的层析方法。把蒽醌甙元分离后就可以分别进行测定，还有薄层后要进行比色检测、薄层后要在斑点显色后进行光密度法、薄层后进行荧光检测以及薄层后薄层扫描等。

3.4 高效液相色谱法

我们应用高速逆流色谱法可以成功的分离以及测定出大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酸和大黄酚这五种蒽醌衍生物的含量。应用高效液相色谱法可以同时测定出大黄中蒽醌、蒽酮、蹂质等几乎所有含酚羟基的成分。也可以用反相高效液相色谱法来检测糖尿灵中成药大黄酸的含量。下面我们用几个简单的表来说明高效液相色谱法，见表1～3。

纸层析图谱和大黄成分的液相色谱图见图2、3。

表1 各因素及水平表

表2 L9（34）正交实验直观分析结果

表3 方差分析

3.5 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法可以简称为HPCE，它是一种利用离子或者荷电粒子把电场作为驱动力而在毛细管中按照其淌度以及分配系数的不同来进行分离的一种新型电泳技术。使用毛细管电色谱法可以分离出大黄中的大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚这四种主要有效的成分，与高效液相色谱法比较，毛细管电泳不仅克服了分析时间长、分离效率低、色谱柱容易被污染等一些难以解决的问题，而且具备高效、迅速、溶剂消耗少、抗污染能力强等优点，因为高效毛细管电泳的这些优点，天然植物及中药的分离分析应用它的范围越来越宽了。

4 4 大黄的抗突变作用

大黄已经被广泛的用于内外科妇女儿童传染等临床的急慢性疾病，像是治疗内科高黏血综合征、高血脂症、卒中风、治疗血症以及幽门弯曲菌阳性的消化性溃肠、治高热症状、便秘和单纯性肥胖症、外科创伤出血、急腹症、术后肠麻痹等[1-3]。除此之外，大黄还具有抗肿瘤作用、增强免疫功能、抗衰老作用以及治疗精神疾病等。在这些传统病症的治疗中，关于大黄的药理作用研究是非常全面、系统的。

近些年以来，大黄的抗突变作用逐步引起关注，但是由于研究系统的不完善，以及相关机制并不清楚。只是由大黄对环磷酰胺诱发的骨髓细胞染色体畸变有一定的抑制作用，所以推测出来大黄对于降低生命机体的脂质过氧化，能够增强机体除掉自由基的能力，它保护了生物膜，这些都很有可能是大黄抗诱变作用的重要原因。但是大黄的药用成分十分复杂，想要确定它准确的抗突变作用有效成分和它的机制还需要我们进行大量的研究工作，这就要我们在以后进行深入的探讨及研究。

综上所述，近几年来纯天然植物药引起了人们的广泛兴趣，作为传统中药的一种，大黄逐渐成为研究的热点话题。由于微波萃取技术的出现以及广泛应用为中药提取提供了一种新的方式，色谱、毛细管电泳理论的逐渐深入，非水毛细管电泳等新方法的逐步出现，这些都为中药的分离、分析提供了越来越先进的技术，超临界流体的引入更为中药的提取和分离带来了非常重要的变化。超临界萃取和超临界流体色谱技术都会在医学领域上更多的应用到大黄乃至其他中药的分析、分离中[4-6]。大黄的抗突变作用也正在逐渐引起重视，这样不仅能够扩大大黄的用途，并且对于大黄和其他中药的开发具有深远的影响。随着科学技术的不断提高，各种各样的先进分析仪器也会逐步出现运用，这些都会加快中药的现代化进程。

[1] 袁倬斌,尚小玉.大黄中有效成分的提取、分离测定及其抗突变作用[J].分析科学学报,2002,18(6):508-512.

[2] 苟奎斌,袁海龙,李仙义.超临界流体萃取法用于大黄素的定量测定研究[J].中国医药学杂志,1999,34(9):145.

[3] 肖艳,杜智敏.大黄中有效成分提取分离条件的优化[J].中国临床药理学与治疗学,2003,8(1):98-100.

[4] 廖华卫,李瑞珍,陈飞苑.大黄中大黄酚的提取、分离和纯化方法研究[J].中国药房,2006,17(12):956.

[5] 曹云丽,黄强,班春兰,等.对中药大黄中蒽醌类物质的提取分离方法的研究[J].云南中医中药杂志,2005,26(1):36-38.

[6] 朱庆玲,李瑞和,石文宏.大黄中大黄素的提取工艺研究[J].时珍国医国药,2006,17(3):388.

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