外周血单核细胞TLR2、TLR4与急性胰腺炎肺损伤的关系

蒋海弦，李天舒，顾国宝，周鸣清，陆仁达

（上海闸北区中心医院，上海200070）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是胰酶引起的一种化学炎症反应性疾病，其出血坏死型（acute necrotizing pancreatitis，ANP）病情凶险，预后差，病死率高达50%左右。急性胰腺炎相关性肺损伤（acute pancreatitis－associated lung injury，APALI）是AP最常见的并发症，是患者早期死亡的重要原因.炎症介质的互相激活和级联反应是APALI的重要发生机制之一。多种炎性因子参与了急性胰腺炎肺损伤的发生，如IL－6，TNF－α，p物质等，其中涉及多种细胞如内皮细胞、单核细胞等［1］。最近研究发现［2］，toll样受体（toll－like receptor，TLR）参与了急性胰腺炎并发肺损伤的过程，敲除TLR4基因的小鼠，急性胰腺炎炎症程度减轻且肺损伤明显减少。但TLR是否与急性胰腺炎肺损伤的发生相关，仍缺乏临床资料。本研究拟回顾分析本院收治的急性胰腺炎患者外周血单核细胞TLR2、4的表达与急性胰腺炎合并肺损伤的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2010年01月－2011年06月我科收治的急性胰腺炎患者30例，其中男性16例，女性14例；年龄21－62岁（平均45.9±12.2岁）；并选择10例体检健康人群作为对照，其中男女性各5例，年龄35－64岁（平均51.1±12.6岁）。

1.2诊断标准

急性胰腺炎诊断标准：符合急性胰腺炎的临床征象（腹痛、腹胀、恶心呕吐、腹部压痛等）；入院时血淀粉酶大于正常上限3倍或以上；有或无影像学诊断（B超或C T）者，无论病情轻重均纳入（参照1992年亚特兰大会议标准［3］或1996年中华医学会外科学会胰腺学组标准［4］。

1.3外周血单核细胞TLR mRNA表达检测

空腹肘静脉全血5ml，参考文献报道方法［5］，采用Ficoll－Hypaque密度分离法分离外周血单核细胞，Trizol抽提总RNA，逆转录成cDNA（Promega公司），等量cDNA依照PCR Kit（Invitrogen公司）提供的步骤进行PCR。参考文献，其引物序列如下：TLR2（6）上游引物CCCAGGAAAGCTCCCAGCAG，下 游 引 物 GGAACCTAGGACTTTATCGCAGCTC；TLR4（7）上游引物CATTCAAGACCAAGCCTTTCAG，下 游 引 物 CCAGGTTTTGAAGGCAAGTTTT；GAPDH（7）上游引物 TGCACCACCAACTGCTTAG，下 游 引 物GGATGC AGGGATGATGTTC。反应条件为94℃预变性7min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共33个循环。PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶，电泳，紫外灯下观察，凝胶分析系统拍照。Quantity one软件分析，目的基因／GAPDH值为相对表达量。按TLR2与TLR4mRNA相对表达量，将急性胰腺炎患者分为TLR2、4高表达组（≥2倍健康组）与低表达组（＜2倍健康组）。

1.4统计分析所有数据采用SPSS 17.0统计软件包处理，其中不同组别间计量资料比较采用t检验；不同分组中急性胰腺炎肺损伤的比较，采用卡方检验，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

与健康组相比较，急性胰腺炎患者外周单核细胞TLR2与TLR4mRNA表达明显升高（P＜0.01）。（图1）

图1 急性胰腺炎TLR2与TLR4蛋白表达

按TLR2mRNA表达水平将急性胰腺炎患者分为两组：TLR2高表达组（≥2倍健康组）与TLR2低表达组（＜2倍健康组），TLR2的表达与急性胰腺炎并发肺损伤无明显相关（P＝0.105），不同TLR2mRNA表达组的急性胰腺炎患者发生肺损伤的OR值3.677倍，但无统计学意义（95%CI：0.733－18.332）（表1）。

表1 不同外周单核细胞TLR2表达急性胰腺炎肺损伤比较

按TLR4mRNA表达水平将急性胰腺炎患者分为两组：TLR4高表达组（≥2倍健康组）与TLR4低表达组（＜2倍健康组），TLR4的表达与急性胰腺炎并发肺损伤明显相关（P＜0.01），不同TLR4mRNA表达组的急性胰腺炎患者发生肺损伤的 OR 值为 18，有统计学意义 （95%CI：2.756－117.544）。

表2 不同外周单核细胞TLR4表达急性胰腺炎肺损伤比较

3 讨论

急性胰腺炎（AP）的发病机制复杂、病程凶险，病死率极高，在其胰外损伤中以急性肺损伤（ALI）最为突出，甚至可继发急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。如何能早期发现或预测急性胰腺炎并发肺损伤的患者，争取早期的干预，对于减少急性胰腺炎病死率有着重要的临床意义。

研究发现，AP中常伴发肠源性内毒素血症，脂多糖（LPS）浓度常常增高［8］。TLR家族是LPS的受体，主要分布在单核／巨噬细胞表面的TLR4、TLR2对LPS炎症信号向胞内转导中起主要作用［9］。TLR2、TLR4与LPS结合后，通过激活单核细胞内的NF－κb信号通路，促进炎性因子如IL－1、TNF等的分泌，从而在急性胰腺炎发生中起着重要的作用［10］。本研究中，我们检测急性胰腺炎的单核细胞TLR2与TLR4的表达，发现TLR2及TLR4mRNA表达水平明显增高，这与前期的研究结果一致。

多项研究表明，AP肺损伤与肺组织内有大量炎性细胞浸润，包括中性粒细胞及单核细胞，单核／巨噬细胞在AP并发肺损伤的发生中起着重要作用［11］。AP发生时，肺部的炎症反应会促使LPS的大量增多，通过TLR受体激活肺部聚集的单核／巨噬细胞，导致肺血管内皮功能的损伤，并抑制Fas基因的表达，减少炎性细胞的凋亡［12，13］，这提示 LPSTLR轴在单核细胞的激活可能是肺损伤发生的关键机制。本研究中，我们通过检测AP并发肺损伤患者单核细胞的LPS主要受体TLR2与TLR4表达，并将其分为（≥2倍健康组）与TLR2低表达组（＜2倍健康组），发现TLR2的表达与AP肺损伤发生之间无明显相关；而TLR4的表达与AP并发肺损伤明显相关，高表达TLR4的患者AP并发肺损伤风险是低表达的18倍，这提示AP单核细胞TLR4的表达高低是AP并发肺损伤的危险因素。前期研究发现，尽管TLR2与TLR4均是LPS的受体，但TLR4主要介导革兰氏阴性菌引起的炎性反应，是LPS在单核细胞效应的主要介导者［9，14］，这可能是TLR4而不是TLR2的在单核细胞的表达是AP并发肺损伤的危险因素。

值得注意的是，本研究虽然提示TLR4的单核细胞的表达是AP并发肺损伤的危险因素，但由于本研究样本量偏小，这可能会造成研究结果的偏倚；另外，由于研究条件的限制，本研究中没有排除患者基础的炎症及免疫状态对单核细胞TLR4预先激活的影响，这些均需要后续深入研究。尽管如此，本研究通过病例对照发现TLR4在单核细胞的表达是AP并发肺损伤的一个危险因素，为AP并发肺损伤的高危人群筛选提供了一个潜在的指标。

［1］许 威 夏，陈 虹.炎症介质与急性胰腺炎相关性肺损伤［J］.世界华人消化杂志，2006，14（12）：1188.

［2］Sharif R，Dawra R，Wasiluk K，Phillips P，Dudeja V，Kurt－Jones E，Finberg R，Saluja A.Impact of toll－like receptor 4on the severity of acute pancreatitis and pancreatitis－associated lung injury in mice［J］.Gut，2009，58（6）：813.

［3］Bradley EL，3rd.A clinically based classification system for acute pancreatitis.Summary of the international symposium on acute pancreatitis［J］.Arch Surg，1993，128（5）：586.

［4］中华医学会外科学会胰腺学组.急性胰腺炎的临床诊断及分级标准［J］.中华外科杂志，1997，35（12）：773.

［5］刘文佳，周 洪，王晓荣.体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究［J］.西安交通大学学报（医学版），2007，28（5）：551.

［6］Lew BL，Sim WY，Kim NI.Expression of toll－like receptor 2in cultured human keratinocytes：The effect of bacterial antigens，cytokines and calcium concentration［J］.Ann Dermatol，2009，21（4）：337.

［7］Lim BJ，Lee D，Hong SW，et al.Toll－like receptor 4signaling is involved in iga－stimulated mesangial cell activation［J］.Yonsei Med J，2011，52（4）：610.

［8］Pascual JL，Khwaja KA，Ferri LE，et al.Hypertonic saline resuscitation attenuates neutrophil lung sequestration and transmigration by diminishing leukocyte－endothelial interactions in a two－hit model of hemorrhagic shock and infection［J］.J Trauma，2003，54（1）：121.

［9］Vabulas RM，Ahmad－Nejad P，Costa C，et al.Endocytosed hsp60s use toll－like receptor 2 （tlr2）and tlr4to activate the toll／interleukin－1receptor signaling pathway in innate immune cells［J］.J Biol Chem，2001，276（33）：31332.

［10］Pandey S，Agrawal DK.Immunobiology of toll－like receptors：E－merging trends［J］.Immunol Cell Biol，2006，84（4）：333.

［11］Misharin AV，Scott Budinger GR，Perlman H.The lung macrophage：A jack of all trades［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，184（5）：497.

［12］Chooklin S.Pathogenic aspects of pulmonary complications in acute pancreatitis patients［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2009，8（2）：186.

［13］Yubero S，Ramudo L，Manso MA，De Dios I.Targeting peripheral immune response reduces the severity of necrotizing acute pancreatitis［J］.Crit Care Med，2009，37（1）：240.

［14］Re F，Strominger JL.Toll－like receptor 2（tlr2）and tlr4differentially activate human dendritic cells［J］.J Biol Chem，2001，276（40）：37692.