悦目金蛛丝蛋白TuSp1重复模块特征

王金雷，陈格飞，李 佳，林 瑛，孟 清

（东华大学 生物科学与技术研究所，上海 201620）

悦目金蛛丝蛋白TuSp1重复模块特征

王金雷，陈格飞，李 佳，林 瑛，孟 清

（东华大学 生物科学与技术研究所，上海 201620）

针对蜘蛛管状腺丝蛋白（TuSp）结构进行克隆和分析，基于悦目金蛛（Argiopeamoena，A.amoena）管状腺总RNA，利用简并引物和巢式聚合酶链反应（PCR）技术克隆Aa TuSp1编码基因序列1 273 bp，其包含3个重复单元，每个重复单元编码176个氨基酸，重复单元之间的序列同源性高达97%以上，且富含丙氨酸（Ala）和丝氨酸（Ser），其次是甘氨酸（Gly），组成了一系列Poly T，Poly A，PolyS，SQ和GX模体结构，推测与其独特的力学性能相关.系统进化分析表明，不同于典型蛛丝蛋白MaSp，Flag等，Aa TuSp1及近系包卵丝蛋白形成一个独立的进化分支.研究结果为基于TuSp1合成仿生蛛丝提供了新的结构基因蓝图.

悦目金蛛；管状腺丝蛋白；重复单元；巢式聚合酶链反应（PCR）；进化

蜘蛛丝是一类具有优良力学性能和生物学特性的天然蛋白聚合纤维，在纺织、生物医学、军工及航空航天等领域有着广阔的应用前景和巨大的商业价值［13］.蜘蛛在漫长的进化过程中，保留着包裹蛛卵的由包卵丝组成的卵袋结构，用于保护蛛卵免受外侵.其中，管状腺分泌的管状腺丝蛋白（tubuliform spidroin，TuSp）经喷丝器合成蛛丝，构成卵袋外层［46］.迄今为止，仅发现一种管状腺丝蛋白，即TuSp1，预测分子量超过300 k Da（编码基因长约12 kb），但结构解析尚未完成［7］.鉴于最具代表性的园蛛科蜘蛛丝蛋白结构（尤其是包卵丝蛋白）现较少报道［810］，亟待解析，国内也多局限在丝纤维力学性能研究［1112］，未见丝蛋白结构方面的报道.本文主要针对蜘蛛管状腺丝蛋白（TuSp1）进行基因克隆和分析.首先基于悦目金蛛（A.amoena）管状腺总RNA，利用简并引物和巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技 术 克 隆Aa TuSp1部分编码基因序列，然后经序列比对分析其模块特征，再经系统进化分析，证实Aa TuSp1及其近系包卵丝蛋白作为一个独立的进化分支，分布于典型蛛丝蛋白（网捕丝，如 MaSp和Flag等）之外，是蜘蛛丝蛋白基因家族的新成员.

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

悦目金蛛采集于上海松江区周边，Trizol®试剂、M-MLV逆转录酶（Invitrogen，USA），PCR克隆试剂盒（CloneJETTMPCR Cloning Kit）、长片段扩增聚合酶（Long PCR Enzyme Mix），引物合成委托上海英骏生物技术有限公司.

1.2 方法

1.2.1 蜘蛛管状腺体分离及其总RNA提取

选取适于解剖的成熟蜘蛛个体，经CO2麻醉后活体解剖获取管状丝腺，解剖缓冲液参考文献［13］配制，液氮冰冻并置于-80℃保存备用.管状腺总RNA提取采用Trizol一步法（参照Trizol®试剂说明书），总RNA置于-80℃保存备用.

1.2.2 简并引物设计及其PCR验证试验

鉴于文献［8］报道蜘蛛包卵丝蛋白为单一外显子编码蛋白质，本文基于已报道序列保守区设计简并引物，并利用基因组DNA进行PCR验证试验.根据现有报道的3条蜘蛛管状腺丝蛋白序列：银金蛛 （A.argentata）TuSp1 （基 因 登 录 号：AAY28932）、横纹金蛛（A.bruennichi）ECP1（基因登录号：BAE86855）、蔽日蛛（A.aurantia）TuSp（基因登录号：AAX45292），经Blockmaker（http：／／blocks.fhcrc.org／blocks／make＿blocks.html）比对，得到高度保守的连续氨基酸区域；登陆Code Hop数据库（http：／／blocks.fhcrc.org／codehop.html）进行简并引物搜索，参数设置为 Maximum core degeneracy：64；Target clamp temperature：60 ℃；Genetic code：standard；Codon usage table：Bombyx mori，Codon usage table一项选用与蜘蛛相似的家蚕作为参考，并结合对上述3条序列重复单元的分析，筛选出1对简并引物，如表1所示.

通过改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法分离悦目金蛛高质量基因组DNA（genomic DNA，gDNA）［14］.以gDNA稀释产物为模板，结合简并引物进行简并PCR扩增，克隆测序目的产物得到一条282 bp DNA序列.经Blast N在线同源比对分析，确定该序列为悦目金蛛包卵丝蛋白TuSp1部分编码序列.根据该DNA序列设计巢式PCR引物，如表1所示，以备后用.

表1 简并引物列表Table 1 Degenerate primers

1.2.3 管状腺丝蛋白TuSp1基因克隆与测序分析

以管状腺腺体总RNA为模板，Outer Primer为反 转 录 引 物，利 用 M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）逆转录酶进行反转录.反转录体系为20μL，反应条件为70℃，10 min；冰上急冷；42℃，1 h；70℃，10 min；以引物S1和Outer Primer为上下游引物进行第1轮扩增，反应体系为Long PCR Enzyme Mix操作体系（50μL），反应条件为94℃，预变性2 min；然后90℃，40 s；50℃，30 s；68℃，1.5 min，10个循环，再经过90℃，40 s；55℃，30 s，68℃，1.5 min，25个循环，其中68℃处理时每一循环增加5 s，最后68℃，10 min.以第1轮扩增产物为模板，以引物S1和Inner Primer为上下游引物进行第2轮扩增，反应体系同第一轮，反应条件为94℃，预变性2 min；然后90℃，40 s；55℃，30 s；68℃，1.5 min，30个循环，最后68℃，10 min.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收，克隆入pJET1.2／blunt cloning vector（CloneJETTMPCR Cloning Kit）送北京华大基因研究中心测序分析.

1.2.4Aa TuSp1序列比对与进化分析

首先，基于Blast X平台检索NCBI蛋白质数据库，随后利用BLASTCLUST鉴定试验获得A.amoenaTuSp1编码基因序列为非冗余序列.然后，利用 EMBOSS程序（equicktandem／etandem）检索重复单元［15］.由DNAMAN V 5.2.2软件完成氨基酸序列预测和氨基酸组成分析工作.

对本文发现的A.amoenaTuSp1序列及文献［16］报道的蛛丝蛋白cDNA序列进行同源比对分析，采用 MEGA V5.0软件［17］进行系统进化分析.

2 研究结果与讨论

2.1 AaTuSp1重复模块序列克隆与序列分析

本文利用巢式PCR扩增获取一条悦目金蛛管状腺丝蛋白编码基因序列1 273 bp（基因登录号：JQ291306），验证试验发现包含1.2.2节中得到的282 bp DNA序列.在线比对分析确定其为TuSp1部分cDNA序列，命名为Aa TuSp1.预测氨基酸序列如图1所示.其中，粗体和白体表示不同重复单元；下划线表示GX（X代表N，F，T，L，I等氨基酸）和Poly T重复模块.编码氨基酸序列长度由424个氨基酸残基组成，包含3个重复单元，每个重复单元528 bp（编码176个氨基酸），重复单元之间的序列同源性高达97%以上.

以Aa TuSp1重复单元为参照，利用Blast P进行GenBank非冗余蛋白库同源搜索比对.借助同源分析结果，对与A.amoena近源的3种蜘蛛（A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus）的TuSp1进行重复单元的划分，A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus的重复单元分别由180，180和184个氨基酸组成，均大于A.amoena包卵丝蛋白Aa TuSp1的重复单元（176个）.现有研究表明，蛛丝蛋白主要由4种典型的重复模块组成：An，（GA）n，（GGX）n和 GPGXn，因此甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）含量较高［1819］.利用DNAMAN软件对A.amoena，A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus重复单元进行氨基酸组成分析，结果如图2所示.由图2可以看出，4种蜘蛛的重复单元均富含Ala和丝氨酸（Ser），且Gly，Ser和Ala含量均高于25%，其氨基酸组成均不同于典型的蛛丝蛋白，并组成了一系列Poly T，Poly A，PolyS，SQ和GX模体结构，推测与其独特的力学性能和生物学特性相关.和SOPMA算法）对该重复单元进行二级结构预测，均证实大多数氨基酸折叠成Helix结构，仅有很少的氨基酸形成Strand结构.由于βsheet结构与蛛丝纤维的强度相关，Helix与延展性对应，因此这种富含Helix结构、缺少Strand结构可以用于解释包卵丝蛋白的低强度和高延伸性，但包卵丝蛋白TuSp1的氨基酸组成和折叠结构与包卵丝纤维的力学性能和生物学特性还有待更深层的研究［25］.

图1 AaTuSp1预测氨基酸序列分析Fig.1 Analysis of predicted amino acid sequence of AaTuSp1

系统进化分析发现，TuSp1与拖丝蛋白（MaSp）和鞭毛状丝蛋白（Flag）分别位于不同的节点之内，如图4所示，这表明包卵丝蛋白是一个新的丝蛋白亚家族.本文发现的Aa TuSp1将为合成仿生蛛丝提供了新的结构基因蓝图.

3 结 语

（1）由于重复单元及其内部重复模体的频繁出现，常规PCR方法获取蜘蛛管状腺丝基因无法获得理想效果，因此成为仿生蛛丝的瓶颈.本文采用简并引物与巢式PCR相结合的方法为蛛丝蛋白基因的获取提供了新思路.

（2）本文发现的Aa TuSp1具有稳定的均匀序列重复特性，重复单元之间同源性高达97%以上，这种结构模式与传统的蛛丝蛋白（如拖丝和鞭毛状丝等）不同.

（3）系统进化分析表明，包卵丝蛋白是一个新的丝蛋白亚家族，这为后续的人工仿生蛛丝提供了基因蓝图.

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Characterization of Spidroin TuSp1 Repeat Module fromArgiopeAmoena

WANGJin-lei，CHENGe-fei，LIJia，LINYing，MENGQing

（Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China）

Cloning and structural analysis of tubuliform spidroin（TuSp）were performed based on the extraction of total RNA ofArgiopeamoenatubuliform，degenerate primers and the technique of nested polymerase chain reaction（PCR）were used to obtainAa TuSp1，which was 1 273 basepairs，and included three repeats.Each repeat contained 176 amino acids，and among these repeats，the identity was up to 97%.The sequence was rich in Ala，Ser and Gly，and formed a series of motifs，such as Poly T，Poly A，PolyS，SQ and GX，which may be related with the mechanical characterization.Phylogenetic analysis demonstrated that AaTuSp1 formed a new branch that was different from MaSp，Flag and so on.The research results provided a new gene blueprint for biomimicing spider silk.

Argiopeamoena；tubuliform spidroin；repeat unit；nested polymerase chain reaction（PCR）；evolution

Q 78

A

2012 02 06

国家“八六三”高技术研究发展计划资助项目（2006AA03Z451）；国家自然科学基金资助项目（31070698）；上海市基础研究重点资助项目（10JC1400300）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20120075110007）

王金雷（1986—），男，上海人，硕士研究生，研究方向为蛛丝蛋白基因的克隆及表达.E-mail：leow＠mail.dhu.edu.cn

孟 清（联系人），男，教授，E-mail：mengqing＠dhu.edu.cn

1671-0444（2013）02-0196-06