商陆皂苷甲对白细胞介素1β诱导的肾小球系膜细胞增殖及Caspase-3的影响

徐丽君 汤杰印 张祥贵 马华林

商陆皂苷甲(Esculentoside A，EsA)是从中草药商陆块根中提纯的一种三萜类皂苷，已被证实有显著调节免疫、抗炎、抑制细胞增殖和促凋亡的作用[1-5]，在自身免疫性肾炎动物模型中显示良好的治疗效果[6-7]。本实验选用大鼠肾小球系膜细胞(rGMC)为对象，观察EsA对体外培养的rGMC增殖影响及促凋亡情况，并探讨其作用机制，为其治疗慢性肾脏病提供实验和理论依据。

1 资料与方法

1.1 材料 rGMC株(HBZY-1)由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供；EsA购自上海同田公司，批号：10072431，白色粉剂(不溶于水)，于实验前溶于0.1%DMSO溶液中；白细胞介素1 β（IL-1 β）购自Prospec公司，生产批号：#407 IL 1 B 01；MTT、DMSO、胰酶均购自Sigma公司，MEM培养液购自Genom公司，优级胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司，细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，兔抗大鼠Caspase-3 (武汉博士德公司)，Actin单克隆抗体(SantaCruz)，HRP标记山羊抗兔(KPL)，PVDF Western转印膜(Millipore)，流式细胞仪(FACS Vantage DiVa，BD)，酶标仪(ELX 800)为Bio-Tek Instruments INK(美国)公司。

1.2 方法

1.2.1 rGMC培养 rGM购回后于倒置显微镜下见细胞呈梭形生长，铺满瓶底，培养液透明清亮，适应性培养4 h后吸取全部培养液（5% FBS的MEM）入无菌瓶内，并将FBS浓度由5%调整为10%做GMC培养备用。用PBS液洗细胞2 次，加入胰酶（含0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA和酚红）消化细胞，见细胞变圆，呈片状脱落时，加入10% FCS的MEM，终止消化，将细胞悬液移入离心管中，800 r/min，4 min离心后，弃去上清液，加入3 mL 10%FCS的MEM培养液重悬细胞，按1∶3 接种于25 mm培养瓶，每瓶加入10%FBS的MEM培养液至5 mL，吹打均匀，放入37℃，5% CO2培养箱中培养，换液2 d/次，细胞生长迅速，3 d传1 次代。本实验采用6～9 代rGMC。

1.2.2 分组 在检测EsA对rGMC的增殖影响中，我们根据EsA浓度分为对照组及20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L共七组，并检测24 h、48 h及72 h各组OD值；对Caspase-3 表达影响中，分为对照组及IL-1 β组与IL-1 β+EsA组共三组。

1.2.3 MTT法测定EsA对rGMC增殖的影响 取对数生长期rGMC接种于96 孔培养板，培养箱中孵育24 h后使rGMC同生长于G0 期。对照组加入10%FBS的MEM培养液，实验组除加入上述培养液外，还分别加入终浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L用DMSO溶解的EsA，上述各组分别培养至24 h，48 h及72 h时，换新鲜培养液，按上述方法加入MTT培养4 h后，加入DMSO振荡10 min溶解结晶物，在酶联免疫检测仪490 nm波长处测定各孔OD值。实验重复4 次。

1.2.4 WB法检测Caspase-3 的表达 提取按上述方法接种、培养、分组作用48 h后各组细胞总蛋白，每组1×106个细胞，用Bradford 法测定蛋白质浓度，并置于-2℃备用。每个样品取30 μg蛋白质加入5×SDS凝胶加样缓冲液使其终浓度成为1×，100℃煮沸5 min，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶45 V 40 min，分离胶120 V 90 min)后，200 mA电转移转至PVDF膜1 h，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入稀释的Caspase-3 (1∶500)一抗和Actin单克隆抗体（1∶1000），室温下孵育2 h，TBST洗膜，加1∶3000 TBST稀释的二抗室温孵育45 min，TBST洗膜，加入等体积混溶的A、B化学发光试剂，保持1.5 min，去尽残夜，曝光成像。照片用GelDoc 2000 凝胶成像系统进行分析，确定杂交条带的光密度值，用各组的光密度值/内参照光密度值进行统计学分析，实验重复3～5 次。

1.2.5 统计学方法 使用SPSS 13.0 软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组资料间均数比较采用方差分析；多个样本均数的两两比较，方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane'sT2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾小球系膜细胞生长形态观察 经传代后rGMC，24 h后几乎全部伸展贴壁，生长迅速，2～3 d铺满瓶底。在倒置显微镜下观察，rGMC呈梭形、不规则形、纺锤形、胞核居细胞中央呈卵圆状，胞体多突起，生长密集时，细胞接触间隙可消失。见图1。

图1a:正常培养的肾小球系膜细胞形态(×40 倍)

图1b:正常培养的肾小球系膜细胞形态(×200 倍）

2.2 EsA对rGMC的增殖影响 与对照组比较，EsA（2.5～5 mg/L）在48、72 h明显抑制了细胞的增殖(P＜0.05 或P＜0.01)，见表1。

表1 EsA对rGMC增殖作用的OD值（±s）

表1 EsA对rGMC增殖作用的OD值（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与对照组比较，bP＜0.05

组别 n OD(24 h) OD(48 h) OD(72 h)对照组 6 0.529±0.081 0.808±0.021 1.331±0.219 EsA(20 mg/L) 6 0.547±0.362 0.863±0.903 1.218±0.165 EsA(10 mg/L) 6 0.547±0.097 0.880±0.080 1.330±0.146 EsA(5 mg/L) 6 0.508±0.018 0.642±0.060 a 0.966±0.325 a EsA(2.5 mg/L) 6 0.478±0.043 0.716±0.081 b 1.032±0.123 b EsA(1.25 mg/L) 6 0.479±0.026 0.815±0.056 1.271±0.185 EsA(0.625 mg/L) 6 0.473±0.053 0.805±0.041 1.232±0.218

2.3 EsA对IL-1 β诱导rGMC的Caspase-3 表达的影响 与对照组比较，IL-1 β组与IL-1 β+EsA组Caspase-3 表达均明显增强（P＜0.05）；与IL-1 β组比较，EsA+IL-1 β组Caspase-3 的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 各组大鼠肾小球系膜细胞的Caspase-3 的表达

3 讨论

EsA是从中国商陆块根中提纯而得到的一种三萜类皂苷化合物，既往研究显示其具有显著的抑制血清中炎性细胞因子(如IL-1、TNFα、IL-6、PAF及活性氮等)的产生及调节免疫系统的作用，具有抑制人角质形成细胞增殖，而改善银屑病病情等作用[5]。研究显示EsA具有抗炎、抑制细胞增殖和促凋亡的作用[8]。

rGMC是肾小球固有细胞之一，正常情况下，几乎不增殖，炎症状态下，可被活化而异常增殖，引起细胞外基质(EMC)增加，降解减少，并释放各种生物活性物质（如生长因子、细胞因子、反应性氧族等）趋化单核细胞及淋巴细胞进入病灶，使其释放炎症介质，进一步活化GMC，形成恶性循环，最终导致肾小球硬化及终末期肾脏病。由于GMC增殖是狼疮性肾炎(LN)等多种肾小球疾病的共同病理表现，抑制GMC增殖对防治系膜细胞增殖性肾小球疾病有重要的临床意义，并已成为研究的热点。为明确EsA在LN等系膜细胞增殖性肾炎肾组织中的作用靶点及机制，同时考虑IL-1 β是刺激GMC活化的主要炎症因子，其在肾脏疾病的发生和发展中的典型性，故本实验选用了IL-1 β作为诱导因子，建立了体外IL-1 β诱导GMC增殖的模型。细胞增殖实验结果显示EsA(2.5～5 mg/L)对血清诱导的rGMC增殖48～72 h有显著的抑制作用，IL-1 β诱导GMC增殖的实验结果与文献报道一致[9]。细胞增殖的实质是促进与抑制，增殖与凋亡的失衡[10]。细胞增殖是通过细胞周期来实现的，细胞的最终命运是在细胞周期水平由共同的调控者——细胞周期调节蛋白决定的[11]。

本研究发现，IL-1 β促进了GMC增殖的同时，也出现了Caspase-3 的表达上调及细胞细胞凋亡率明显增加，说明细胞周期启动后凋亡敏感性增加，细胞处于功能活跃阶段易于凋亡[12]，即激活诱导性细胞凋亡(AICD)，进一步说明了细胞周期与细胞凋亡的协调（CAP）。同时在流式细胞仪检测的结果中发现细胞凋亡处于早期，未检测到晚期细胞凋亡和细胞坏死的凋亡峰，可能与实验中时间的点选择有关。本实验中EsA对IL-1 β诱导的rGMC的细胞增殖中表现的凋亡并无促进作用，提示体外EsA作用于IL-1 β诱导的rGMC无促进凋亡作用，而其在体内的促进肾组织凋亡的作用，可能是EsA对GMC的凋亡无促进作用，而是促进了肾脏其他组织的凋亡，也可能是EsA通过影响多重细胞因子的分泌，调整了体内Th1/Th2的细胞因子平衡，或是通过体内的生物转化后产生其他生物活性物质而促进了GMC等肾组织的凋亡，IL-1 β也可能会对不同的细胞或者细胞在不同的环境诱导中表现出凋亡或增殖为主的现象，需行进一步研究以证实。

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