HPLC-ELSD法测定青葙子中青葙苷I

王玉梅， 喻 悦， 李会军

（天然药物活性与药效国家重点实验室，中国药科大学，江苏南京 210009）

HPLC-ELSD法测定青葙子中青葙苷I

王玉梅， 喻 悦， 李会军*

（天然药物活性与药效国家重点实验室，中国药科大学，江苏南京 210009）

目的 建立青葙子中青葙苷I的HPLC-ELSD测定方法。方法 以Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）色谱柱为固定相，以乙腈-水 （0.1%甲酸）为流动相，梯度洗脱，体积流量1 mL/min，蒸发光散射检测器检测。结果 青葙苷I在0.4～6.4 μg范围内，进样量的对数值与峰面积的对数值之间有良好的线性关系 （Y=1.045 5X+7.278 5，r2=0.999 4），平均回收率为98.7%，RSD为2.6%（n=9）；测得10批青葙子药材中青葙苷I的量为0.166 7%～0.313 2%。结论 所建立的HPLC-ELSD测定方法灵敏度高，重复性好，结果准确可靠，可用于青葙子质量控制。

青葙子；高效液相色谱蒸发光散射检测法；青葙苷I

青葙子为苋科Amaranthaceae一年生草本植物 青葙Celosia argentea L.的干燥成熟种子，具清肝、明目，退翳之功效［1］。研究［2-7］发现青葙子所含的三萜皂苷类成分青葙苷A ～G（celosin A ～G）、鸡冠花苷 （cristatain）等具有保肝、抗肿瘤等药理活性，是青葙子的主要药效成分。文献［8］曾采用高效液相色谱蒸发光散射检测法 （HPLC-ELSD）测定了青葙子中青葙苷A和青葙苷B的量。

2010年版《中国药典》收载的青葙子药材质量标准，尚缺少【含量测定】项。为提高青葙子质量控制水平，本课题组对青葙子进行化学成分研究，发现青葙苷I（celosin I）是青葙子中主要的皂苷类成分 （相关研究结果另文发表）。在此基础上，本研究建立了青葙子中青葙苷 I的 HPLCELSD定量测定方法，以期为青葙子的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括G1311A二元泵、G1313A自动进样器、G1314A VWD检测器、Chemstation 6.01色谱工作站）；HS3120型超声波提取器 （300 W，100 kHz，中国昆山禾创超声仪有限公司）；Sartorius BT224S电子天平 （十万分之一，德国Sartorius公司）；METTLER TOLEDO XS105电子天平 （百万分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司）；MUL—9000Series超纯水系统 （美国 Millipore公司）。

1.2 试药 实验共收集10批青葙子样品 （QXZ-1～QXZ-10），各批药材经中国药科大学生药学与药用植物学教研室李会军教授鉴定为苋科植物青葙Celosia argentea L.的干燥成熟种子，凭证标本保存于天然药物活性与药效国家重点实验室（中国药科大学）。青葙苷I对照品由本实验室制备，经HR-ESI-MS、1D-、2D-NMR鉴定结构 （图1），经HPLC-ELSD法测定纯度达98.5%以上。乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品贮备液的制备 精密称取青葙苷I对照品1.94 mg，置5 mL量瓶中，加水溶解，定容，摇匀，即得0.388 mg/mL的青葙苷I对照品贮备液。

图1 青葙苷I的结构式Fig.1 Structure of celosin I

2.1.2 供试品溶液的制备 取干燥至恒定质量的青葙子粉末 （过40目筛）约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加50%甲醇50 mL，称定，热回流提取1 h，放冷，补足失质量，滤过，取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加水溶解并转移至5 mL量瓶中，定容，摇匀，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性实验 Shim-pack CLC-ODS色谱柱 （6.0 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈 （A）-0.1%甲酸 （B），梯度洗脱，0～5 min（20%A），5 ～ 10 min（20%→30%A），10～20 min（30%→36%A），20～27 min（36%A），27～30 min（36%→100%A），30～35 min（100%A）；体积流量1 mL/min；蒸发光散射检测器漂移管温度105℃，载气体积流量2.8 L/min。在该色谱条件下，青葙苷I色谱峰的分离度大于1.5（见图2）。

图2 对照品和样品的色谱图Fig.2 Chromatogramsofreference substances and sample

2.3 专属性考察 采用液质联用的方法进行专属性考察，色谱分离按2.2项色谱条件，检测器采用Agilent 1100 series LC/MSD系统 （Agilent，Germa-ny），电喷雾 （ESI）离子源。质谱检测条件为：Scan mode（m/z 100～1 500），负离子模式，氮气体积流量为9.0 L/min，干燥气体温度为320℃，雾化压力35 psig（1 psig=68 194.8 Pa），毛细管电压3 500 V。结果表明，在选定的色谱条件下，青葙苷I色谱峰为单一成分，空白溶剂及样品中其他成分无干扰。见图3。

图3 空白溶剂、对照品及样品总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of black，reference substance and sample

2.4 线性关系考察 制备一定质量浓度对照品溶液并稀释得到6个质量浓度的对照品稀释溶液（分 别 为 0.640、0.384、0.320、0.160、0.080、0.040 mg/mL）。按2.2项色谱条件，每个质量浓度进样10 μL，测定峰面积，以进样量的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，并以最小二乘法计算得回归方程：Y =1.045 5 X+7.278 5（r2=0.999 4），表明青葙苷I在0.4～6.4 μg范围内，进样量的对数值与峰面积的对数值之间呈良好的线性关系。

2.5 检测限及定量限测定 按2.2项色谱条件，首先进样空白溶剂，测出对照品出峰位置的基线噪音水平。再进样线性测定中浓度最低的青葙苷I对照品稀释溶液，根据其对应的峰高值，将此溶液稀释至约3倍信噪比的浓度 （S/N=3），即为检测限 （LOD）；约10倍信噪比的浓度 （S/N=10）即为定量限 （LOQ），结果青葙苷I LOD为0.272 μg，LOQ 为 0.466 μg。

2.6 精密度试验 取青葙苷I对照品贮备液（0.388 mg/mL），于一天之内重复进样6次，测定峰面积，计算RSD值为2.6%（n=6），作为日内精密度；连续进样3 d，每天进样3次，测定峰面积，计算RSD值为2.8%（n=9），作为日间精密度；实验室另一操作人员按2.3项制备供试品溶液，按2.2项色谱条件测定青葙子粉末中青葙苷I的量，每个样品连续进3次，测定，计算RSD值为2.8%（n=6），作为中间精密度。结果表明精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批次青葙子粉末 （QXZ-1）6份，每份1 g，精密称定，按2.3项制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算青葙苷 I含有量为 （0.233 0 ±0.005 7）%，RSD值为3.1%（n=6）。结果表明，该方法重复性较好。

2.8 准确度试验 取已准确测定含有量的青葙子粉末 （QXZ-1）约0.5 g，共9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入高、中、低质量浓度 （分别为1.342、1.170、0.944 mg/mL）的对照品溶液适量，按2.3项方法制备供试品溶液，按2.2项色谱条件检测，计算加样回收率。结果表明，高、中、低三个质量浓度的加样回收率均在95%～105%范围内，RSD为2.6% （结果见表1）。

表1 青葙子中青葙苷I的加样回收率Tab.1 Recovery tests of celosin I in Celosiae Semen

2.9 耐用性考察

2.9.1 稳定性试验 取青葙子粉末1 g，精密称定，按2.3项制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积并计算RSD值为2.8% （n=6），结果发现稳定性良好。

2.9.2 不同色谱柱的考察 采用Agilent1100系列高效液相色谱仪，考察了3种类型C18色谱柱对分离度的影响，结果发现青葙苷I均能得到较好的分离 （如图4所示）。

图4 不同色谱柱的色谱图Fig.4 Chromatograms of different columns

3 样品测定

取青葙子样品，按2.3项方法制备供试品溶液，按2.2项色谱条件，分别精密吸取对照品贮备液5 μL、10 μL，供试品溶液 10 μL，注入液相色谱仪，测定，按外标两点法对数方程计算青葙苷I量。10批青葙子测定结果见表2。

表2 不同产地青葙子中青葙苷I测定结果 （n=3）Tab.2 Contents of celosin I in different samples（n=3）

4 讨论

皂苷常用的定量方法主要为高效液相色谱法（HPLC），所用检测器有紫外检测器 （UV）和蒸发光散射检测器 （ELSD）。由于皂苷类化合物结构中缺乏共轭体系，因此在选用UV时常在末端吸收区进行检测，易导致基线不稳。ELSD为质量通用型检测器，其响应值与样品的质量成正比，不依赖于样品的光学特性，不受化合物官能团的影响，可消除流动相的配比变化对基线产生的影响，在皂苷类成分的分析中被广泛应用［9-13］。本实验对比UV（203 nm）和ELSD检测，发现在采用梯度洗脱程序时前者基线漂移较大，不能准确定量目标成分；后者基线平稳，且灵敏度更高。故本实验采用HPLC-ELSD法测定。

实验对提取条件如提取溶剂、提取方式、提取时间进行考察，综合考虑青葙苷I提取率、提取时间等因素，最终确定提取溶剂为50%甲醇，提取方式为加热回流，提取时间为1 h。实验还比较了Agilent Extend C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）、Innovation TMInfinite C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）等3种不同类型的色谱柱，结果在这3种类型色谱柱上青葙苷I均能得到基线分离，表明本实验的色谱条件具有较好的适用性。

样品测定结果表明10批青葙子药材中青葙苷I的量在0.166 7%～0.313 2%之间，平均含有量为0.228 2%，高于文献报道青葙苷A（0.051 2%～0.114 3%）和青葙苷B量（0.010 9% ～0.081 5%），故认为青葙苷I为青葙子的主要成分，可作为青葙子的质量控制指标。

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Assay of celosin I in Celosiae Semen by HPLC-ELSD

WANG Yu-mei， YU Yue， LI Hui-jun*
（State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Celosiae Semen；HPLC-ELSD；celosin I

R284.1

A

1001-1528（2013）09-1957-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.09.029

2013-04-18

2010—2011年度国家药品标准提高科研项目 （661）

王玉梅 （1986—），女，硕士生，主要从事中药质量标准研究。Tel：18762407833，E-mail：mouyuzi@163.com

*通信作者：李会军，男，教授，主要从事中药活性成分与质量标准研究。Tel：（025）83271382/13813985884，E-mail：cpuli@163.com