混料设计法应用于多菌种发酵制备大豆凝胶蛋白

何秋实

(青岛酒店管理职业技术学院，青岛 266100)

大豆分离蛋白(SPI)是一种重要植物蛋白产品，不仅具有很高的营养价值，而且具有多种功能性质，如凝胶性、乳化性、持水性等［1］。凝胶性质是大豆蛋白产品在食品中应用最重要的功能特性之一，蛋白凝胶网状结构可吸附水分、脂肪、风味物质、糖及其他成分，因此广泛应用于肉制品、膨化食品和浓缩食品等许多食品当中［2］。乳酸菌是人体肠道中的重要微生物，能调节人体肠道微生物的菌群平衡，与人体健康息息相关［3］。如果将混合乳酸菌引入SPI中进行发酵，乳酸菌可以利用单糖发酵产酸，诱导SPI形成凝胶;同时部分蛋白质经乳酸菌发酵产生多肽，有利于改善SPI凝胶的功能性和营养性。国内外大多数文献都是将乳酸菌用来发酵乳蛋白，而在SPI中的应用研究较少，采用混合菌发酵SPI的研究更少。

欲寻找混合菌发酵SPI制备凝胶最佳配方，需进行混料设计。在混料设计中，单纯型重心设计、单纯型格子设计和轴设计等都是主要的混料设计方法［4］。混料试验设计已广泛应用于食品产品的配方试验研究中，特别是各组分间有交互作用的情况下［5－8］。Gobbetti等［9］利用从开菲尔中分离到的菌株进行多种比例混合，发酵牛奶，尝试用混合菌种代替开菲尔粒。周剑忠等［10］采用混料设计研究了发酵剂中5种菌种的不同组合对发酵奶风味成分的影响，获得藏灵菇奶纯培养发酵剂的最优组合为乳酸乳球菌27%、明串珠菌37%、开菲尔乳杆菌11%、干酪乳杆菌10%、克鲁维酵母15%。

本试验采用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌及其混合菌对大豆分离蛋白进行发酵，应用流变仪和质构仪等手段进行分析，比较单一菌和混合菌发酵产酸性能及对SPI凝胶性质的影响，并对混合菌发酵SPI制备凝胶的发酵条件和混合菌配比进行优化。通过试验分析了解其变化规律，为提高我国大豆蛋白的功能性和应用价值提供一定参考，改善和拓宽SPI在食品、医药领域的应用。

1 材料与方法

1.1 试验原料

SPI购自哈高科食品有限责任公司(蛋白质含量92.4%)，发酵菌种(保加利亚乳杆菌L12，嗜热链球菌S1，嗜酸乳杆菌LA2)由东北农业大学乳品重点试验室提供。

1.2 仪器与设备

高压灭菌锅:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PHS－3C型酸度计:上海鹏顺科学仪器有限公司;精密电动搅拌机:江苏省金坛市荣华仪器;电热恒温水浴锅:余姚市东方电工仪器厂;恒温培养箱:北京市永光明医疗仪器厂;TA－XT2i质构仪:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;马尔文旋转流变仪:天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

培养基配方(改良MRS液体培养基):5.00 g乙酸钠，2.00 g 柠檬酸二胺，2.00 g 磷酸氢二钾，0.25 g硫酸锰，0.10 g 硫酸镁，5.00 g 蛋白胨，10.00 g 葡萄糖，10.00 g胰蛋白胨，5.00 g 牛肉膏，5.00 g 酵母膏，1.00 g吐温80，1 000 mL蒸馏水，加热直到完全溶解。

从冷冻保存菌株的冻存管中取300 μL菌液接入10 mL灭菌的MRS液体培养基中，40℃下静置培养24 h，然后吸取1.5 mL菌液于50 mL灭菌的MRS液体培养基中，40℃下静置培养18 h，再吸取3 mL菌液于100 mL灭菌的MRS液体培养基中，40℃下静置培养16 h作为发酵种子液。

1.3.2 混合菌发酵SPI制备凝胶工艺过程

称取一定量SPI，加水搅拌使其溶解，再添加葡萄糖，搅拌水化30 min，得到SPI溶液。60℃杀菌30 min，杀菌后，快速冷却至室温。在无菌条件下，将培养好的不同菌种以一定比例接种到已杀菌的SPI溶液中，充分混合。将接种后的溶液放在恒温培养箱中，恒温发酵产凝胶，4℃冷藏12 h。

1.3.3 混合菌发酵条件的确定

基本发酵条件:SPI质量分数12%，葡萄糖添加量5%，混合菌接种量3%，40℃发酵5 h。首先在基本发酵条件下，考察单一菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌)和混合菌(3种菌配比1∶1∶1)的发酵产酸性能及对SPI凝胶流变性的影响。然后将混合菌接种到SPI溶液中，观察发酵状态，测定SPI凝胶的强度和持水率。在其他条件不变的情况下，选取SPI质量分数为8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%，葡萄糖添加量3%、4%、5%、6%、7%，混合菌接种量1%、2%、3%、4%、5%，发酵温度36、38、40、42、44 ℃。

1.3.4 混合菌复配比例的优化

试验采用混料设计中的单纯型重心(Simplex Centroid)试验设计。在单因素试验的基础上，根据混料试验设计原理，利用Design－Expert软件中的单纯型重心设计进行过程优化，以凝胶强度R1(g)和持水性R2(%)为响应值，选择保加利亚乳杆菌添加量X1(%)、嗜热链球菌添加量X2(%)、嗜酸乳杆菌添加量X3(%)和发酵时间X4(h)为影响因素，每个因素设定5个水平进行试验，其因素水平编码表见表1。

表1 因素水平编码表

1.3.5 pH 和酸度的测定

采用PHS－3C型酸度计测定样品溶液pH，在不同发酵时间测定SPI发酵液的pH。酸度(°T)采用滴定法进行测定［11］。

1.3.6 凝胶流变性的测定

将接菌后的样品溶液混合均匀，取一定量置于流变仪的承载器中，设定上下探测平行板距离1 mm，待板间完全充满样品溶液，擦去多余溢出的溶液，加上保温套。先进行动态应变扫描，应变保持在线性粘弹区域。然后将温度调节到实验所需温度，进行时间扫描，扫描频率为1 Hz，40℃下连续测定4 h。

1.3.7 凝胶强度的测定

将凝胶样品置于质构仪中，采用TPA穿刺法对凝胶强度进行测定。测前速度:2.0 mm/s，测中速度:l.0 mm/s，测后速度:2.0 mm/s，测定距离:凝胶厚度的40%，两次下压间隔时间:3.0 s，触发力:5 g，触发类型:自动，探头类型:P/0.5，每个试验重复3次。凝胶强度用硬度(Hardness)表示，即探头下压过程中的最大感应力(单位g)。

1.3.8 持水率的测定

称取一定质量的凝胶体样品，放入离心管中，然后在转速4 000 r/min下离心20 min，除去上清夜称重，凝胶持水率按下式计算:

持水率=m2/m1×100%

式中:m1为离心前凝胶质量;m2为吸去水分后凝胶质量。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌发酵产酸性能及对SPI凝胶流变性的影响

图1为不同乳酸菌及其混合菌发酵产酸曲线。由图1可以看出，不同乳酸菌对SPI发酵液pH和酸度的影响有所不同，随着发酵时间的延长，pH逐渐降低，发酵酸度均逐渐增大。在发酵前期，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌产酸速率较快，使SPI发酵液pH下降的较快，酸度升高的较快;随着发酵时间的延长，嗜酸乳杆菌对SPI发酵液pH和酸度的影响越来越显著;在发酵后期，嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌最终的pH和发酵酸度相近，说明两者发酵产酸性能相近。从总体上看，保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌对SPI发酵液pH和酸度的影响较为显著，且产酸能力强于嗜热链球菌。图1中混合菌发酵液的pH低于单一菌发酵液的pH，而酸度高于单一菌发酵液，说明混合菌的发酵产酸性能优于单一菌。原因可能由于混合菌相互之间是互利共生的关系，彼此能够提供各自生长所需的条件，因此发酵产酸性能优于单一菌。发酵产酸性能的顺序:混合菌＞保加利亚乳杆菌＞嗜酸乳杆菌＞嗜热链球菌。

不同乳酸菌及其混合菌对SPI凝胶流变性的影响见图2。由图2可以看出，无论是单一菌还是混合菌发酵SPI体系，弹性模量G'比黏性模量G″大的很多，即体系呈弹性较大的凝胶态。单一菌中保加利亚乳杆菌发酵SPI的 G'最高，其次是嗜酸乳杆菌，最低的是嗜热链球菌，表明保加利亚乳杆菌发酵SPI体系的凝胶强度最大。原因可能是保加利亚乳杆菌发酵SPI体系产酸速度较快且pH最低、酸度最高(图1)，接近SPI等电点(pH 4.5)，在等电点附近由于蛋白质分子之间有强的作用力［12］，有利于SPI凝胶网络的形成。混合菌发酵SPI体系的G'比单一菌发酵SPI体系的G'高，表明混合菌发酵SPI体系的凝胶强度优于单一菌发酵SPI体系。综合考虑，本试验对混合菌发酵SPI体系制备凝胶工艺进行研究。

2.2 不同发酵条件对SPI凝胶的影响

如图3所示，SPI质量分数、葡萄糖添加量、接种量和发酵温度对混合菌发酵SPI体系制备凝胶均有影响。

图3 不同发酵条件对SPI凝胶强度和持水率的影响

由图3a和图3b可知，随着SPI质量分数和葡萄糖添加量的增加，凝胶强度和持水率先逐渐增加，随后保持平缓。这可能是由于蛋白质量分数的升高增加了蛋白间及蛋白与多肽间碰撞的概率，从而使凝胶网络结构更加紧密，使凝胶强度和持水率增加［13－14］;而蛋白质量分数较低时，蛋白质 － 溶剂的相互作用占主导使体系不易形成凝胶［15］。另外，葡萄糖作为乳酸菌的碳源，在一定范围内，葡萄糖添加量会影响乳酸菌的生长，从而影响其发酵产酸能力以及凝胶强度和持水率。由图3c和图3d可知，随着接种量和发酵温度的增加，凝胶强度和持水率先增加后降低。酸致凝胶在pH下降过程中的分子重排是增强网络结构的基础，由于高接种量使混合菌发酵SPI体系的pH下降的过快，没有足够的时间发生分子重排就已到达发酵终点［16］，因此过高的接种量使凝胶强度和持水率降低。而发酵温度高于菌株的最适生长温度会影响菌株新陈代谢速率，降低其发酵能力，使凝胶强度和持水率降低。综合考虑，选择SPI质量分数12%，葡萄糖添加量5%，混合菌接种量3%，发酵温度40℃。

2.3 混合菌最佳配比及发酵条件的优化

以保加利亚乳杆菌添加量X1(%)、嗜热链球菌添加量X2(%)、嗜酸乳杆菌添加量X3(%)、发酵时间X4(h)分别代表的因素为自变量，以凝胶强度R1(g)和持水率R2(%)为因变量，试验设计与数据处理采用统计软件Design－Expert来完成，试验设计及结果见表2。

表2 试验安排及结果

续表

通过统计分析软件Design－Expert进行数据分析，建立凝胶强度回归模型如下:R1=130.26X1+83.84X2+115.40X3+90.00X4－ 51.30X1X2－213.02X1X3+135.71X1X4－11.25X2X3+71.02X2X4+125.97X3X4+1 081.87X1X2X3－ 191.71X1X2X4+620.48X1X3X4+17.83X2X3X4

采用Design－Expert软件对凝胶强度模型方程进行方差分析，结果见表3。

表3 凝胶硬度回归方程的方差分析结果

由表3可知，该模型回归显著(P＜0.05)，失拟项不显著(P＞0.05)，并且该模型 R12=96.8%，R12Adj=92.63%，说明该模型能很好地拟合该试验。通过F值和P值可知X1X2X3之间的交互作用和X1X3X4之间的交互作用对凝胶强度影响显著，也就是说3种乳酸菌添加量之间的交互作用和保加利亚乳杆菌添加量、嗜酸乳杆菌添加量及发酵时间3者之间的交互作用对凝胶强度影响显著。交互作用对凝胶强度的等高线分析见图4。

通过统计分析软件Design－Expert进行数据分析，建立凝胶持水率回归模型如下:

R2=74.67X1+82.45X2+73.74X3+69.96X4－22.12X1X2－ 27.83X1X3+42.72X1X4－ 4.77X2X3+41.29X2X4+21.72X3X4+144.40X1X2X3+152.74X1X2X4－133.58X1X3X4+128.81X2X3X4

采用Design－Expert软件对凝胶持水率模型方程进行方差分析，结果见表4。

表4 凝胶持水率回归方程的方差分析结果

由表4可知，该模型回归显著(P＜0.05)，失拟项不显著(P ＞0.05)，并且该模型 R22=94.34%，R22Adj=86.98%，说明该模型能很好地拟合该试验。通过F值和P值可知X1X2X3之间的交互作用和X1X2X4之间的交互作用对持水率影响显著，也就是说3种乳酸菌添加量之间的交互作用和保加利亚乳杆菌添加量、嗜热链球菌添加量及发酵时间3者之间的交互作用对持水率的影响显著。交互作用对凝胶持水率的等高线分析见图5。

图4 混料设计因素交互项对凝胶强度的等高线分析

由图4可以看出，X1(保加利亚乳杆菌添加量)、X2(嗜热链球菌添加量)、X3(嗜酸乳杆菌添加量)、X4(发酵时间)的交互作用对凝胶强度的影响。当发酵时间固定时，保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌以一定比例混合，凝胶强度有较大值;而嗜热链球菌添加量对凝胶强度影响很小。当乳酸菌添加量固定时，凝胶强度随着发酵时间的延长呈先下降后上升趋势。

图5 混料设计因素交互项对凝胶持水率的等高线分析

由图5可以看出，X1(保加利亚乳杆菌添加量)、X2(嗜热链球菌添加量)、X3(嗜酸乳杆菌添加量)、X4(发酵时间)的交互作用对凝胶持水率的影响。当发酵时间固定时，凝胶持水率随着嗜热链球菌添加量的增加而显著增加;当3种乳酸菌以一定比例混合时，凝胶持水率有较大值。发酵时间过长，凝胶持水率反而下降。

图6为混合菌最佳配比的混料设计优化结果。由图6可知，当混合菌发酵时间编码为0.454水平即4.82 h时，无需添加嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌添加量与嗜酸乳杆菌添加量水平值配比为42.3∶12.3，即保加利亚乳杆菌添加量1.27%、嗜酸乳杆菌添加量0.37%，凝胶强度有较大值在146.823 g左右。当混合菌发酵时间编码为0.462水平即4.85 h时，保加利亚乳杆菌添加量、嗜热链球菌添加量与嗜酸乳杆菌添加量水平值配比为 16.04∶33.11∶4.61，即保加利亚乳杆菌添加量0.48%、嗜热链球菌添加量0.99%、嗜酸乳杆菌添加量0.14%，凝胶持水率有较大值在88.49%左右。

图6 混合菌配比对凝胶强度(a)和持水率(b)的混料设计优化结果

为了验证模型预测的准确性，基于单因素试验的结果，分别按照凝胶强度最大值优化的配比和凝胶持水率最大值优化的配比重复5次验证试验取平均值。当保加利亚乳杆菌添加量1.27%、嗜酸乳杆菌添加量0.37%，发酵4.82 h时，凝胶强度平均值为145.98 g与预测值146.823 g较接近;当保加利亚乳杆菌添加量0.48%、嗜热链球菌添加量0.99%、嗜酸乳杆菌添加量0.14%，发酵4.85 h时，凝胶持水率平均值为87.28%与预测值88.49%较接近。由于优化凝胶强度的发酵时间(4.82 h)和优化凝胶持水率的发酵时间(4.85 h)非常接近，因此确定发酵时间为4.8 h，改变混合菌配比就可得到不同性能的SPI凝胶。最终确定混合菌发酵SPI制备凝胶最优工艺为:SPI质量分数12%，葡萄糖添加量5%，40℃发酵4.8 h，4℃冷藏12 h。当保加利亚乳杆菌添加量1.27%、嗜酸乳杆菌添加量0.37%时，可得到凝胶强度较大的 SPI凝胶;当保加利亚乳杆菌添加量0.48%、嗜热链球菌添加量0.99%、嗜酸乳杆菌添加量0.14%时，可得到持水率较大的SPI凝胶。

3 结论

不同乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌)及其混合菌发酵对SPI体系凝胶性质的影响不同，混合菌的发酵产酸性能最好，并且混合菌发酵SPI体系的弹性模量G'最高。在单因素试验的基础上，采用混料设法对混合菌发酵SPI制备凝胶的发酵条件和混合菌配比进行优化，确定制备SPI凝胶的最佳发酵条件为:SPI质量分数12%，葡萄糖添加量5%，40℃发酵4.8 h，4℃冷藏12 h。改变保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌3者的配比可得到不同性能的SPI凝胶。当保加利亚乳杆菌添加量1.27%、嗜酸乳杆菌添加量0.37%时，可得到高强度的SPI凝胶，最优凝胶强度为145.98 g;当保加利亚乳杆菌添加量0.48%、嗜热链球菌添加量0.99%、嗜酸乳杆菌添加量0.14%，可得到高持水率的SPI凝胶，最优持水率为87.28%。

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