酸性电解水冰理化指标变化对副溶血性弧菌杀菌效果的影响

李继兵 ， 林 婷 ， 廖 超 ， 靳梦曈 ， 潘迎捷 ，2，3， 赵 勇 *，2，3

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海201306）

近年来，电解水冰逐步成为一种新型的冷杀菌保鲜技术。该技术不仅结合了普通冰的低温优势，而且结合了电解水快速、广谱杀灭微生物的优点[1]。目前，有关电解水冰的研究主要涉及食品保鲜和微生物杀灭等方面。Feliciano[2]等研究表明，电解水冰可减少鱼片中大肠杆菌和恶臭假单胞菌数量；Kim[3]研究表明，电解水冰可以显著阻碍鱼中需氧菌和嗜冷细菌的生长；同时，与普通自来水冰对秋刀鱼的保存相比，电解水冰可以延长大约4～5 d的货架期；Phuvasate[4]等研究发现，电解水冰可有效地杀灭大肠杆菌，并可降低贮藏食品物体表面或鱼体表面能够产生组胺的细菌；Koseki[5]等研究表明，酸性电解水冰可有效地杀灭和抑制生菜上单增李斯特菌和大肠杆菌。以上研究表明，电解水冰可以有效地杀灭细菌，并延长食品的货架期。因此，探究电解水冰的挥发动力学，将有助于应用电解水冰更好地保障食品的良好品质。

许多学者研究了酸性电解水在不同保存条件下其理化性质如pH值、氧化还原电位（ORP）和有效氯含量（ACC）等随时间的变化情况[6-9]。然而，对电解水冰理化指标pH、ORP和ACC的系统性研究较少，且对电解水冰理化指标随时间的变化及其对微生物的杀菌效果尚未报道。

作者主要研究了不同浓度的电解水冰在保存过程中其主要理化指标随时间（0、2、4、6、8、10 h）延长而变化的情况，以及相应保存时间下电解水冰对副溶血性弧菌的杀灭效果。同时检测酸性电解水冰处理液中微生物残留情况，为酸性电解水冰推广应用于食品的杀菌和保鲜奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 副溶血性弧菌ATCC33847：购自中国科学院微生物研究所。

1.1.2 培养基、试剂和设备 胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）、TCBS培养基：购自上海市疾病预防控制中心；配制0.85%灭菌生理盐水所用NaCl及NaS2O3、NaH2PO4、Na2HPO4等化学试剂：均为分析纯。FW～200型强AEW生成器（可同时生产2 L酸性电解水和2 L碱性电解水）：日本AMANO公司；超净工作台 ：ESCO WORLD CLASS WORLDWIDE；pH/ORP测定仪：梅特勒～托利多仪器上海有限公司；RC-3F型高浓度有效氯测定仪（测量范围：0～300 mg/L，分辨率：1 mg/L）：日本；QL-901型漩涡振荡器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；MLS-3750高压灭菌锅：三洋电机生物医药株式会社之子公司；移液枪等。

1.2 试验方法

1.2.1 酸性电解水冰的制备 采用二槽隔膜电解水装置，通过调节电压、电流、电解时间，将不同质量浓度 NaCl溶液 （NaCl质量浓度为 0.75、1、1.25、1.50、1.75 g/L）电解制得不同浓度酸性电解水（AEW）。制备酸性电解水6 L，置于密封塑料袋内、避光保存，于-36℃的冰箱内放置24 h，制得酸性电解水冰 （AEW-ice）。

1.2.2 电解水冰的主要理化特性的测定 将制备后的电解水冰块敲成碎冰。为了模拟超市食品保存情景，将敲碎的冰放于不锈钢铁盒（72 cm×48 cm×9.5 cm）内，然后放置在不断制冷的无盖冰箱上。对制备获得的各不同浓度酸性电解水冰（AEW-ice）在0、2、4、6、8、10 h 进行随机取样，使其在 60 ℃水浴锅中立即融化，测定电解水冰的pH值、ORP和ACC。

1.2.3 菌液的制备及菌悬液的制备 将甘油保藏的副溶血性弧菌ATCC33847接种到9 mL无菌3%NaCl的胰蛋白酶大豆肉汤中，37℃和180 r/min摇床培养12 h活化，第二次活化接种5管9 mL 3%NaCl的胰蛋白酶大豆肉汤，将活化后获得的菌悬液在10℃下以 3 000 r/min离心10 min，弃上清液，将沉淀悬浮于20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，混匀，测其OD值。最终获得的菌液含菌量约为9 lg（CFU/mL），备用。

1.2.4 电解水冰处理及增菌试验 不同的时间点取酸性电解水冰，在无菌条件下，将1 mL制备的菌悬液分别加入装有1 mL的酸性电解水冰 （NaCl质量浓度为 0.75、1、1.25、1.5、1.75 g/L）融化液的试管中，立即混匀，反应时间为15 s。取0.5 mL以上反应液加入到装有4.5 mL无菌的中和剂溶液 （含0.5%NaS2O3的PBS缓冲液[10]）试管中，振荡混匀，以终止反应。运用0.85%生理盐水进行梯度稀释，并取100 μL的稀释液涂布到TCBS琼脂平板上，37℃培养24 h后计数。

为了检测酸性电解水冰融化液处理后可能残存的极少量菌，一方面选择合适稀释度涂布于TCBS琼脂平板上，37℃培养24 h后计数。另一方面需要做增菌试验，即从酸性电解水冰融化液中吸取100 μL加入到10 mL TSB培养基，以180 r/min于37℃摇床培养24 h增菌，结束后直接涂布于TCBS平板上，37℃培养24 h后计数。若计数结果为0，则增菌结果为阴性；反之，增菌结果为阳性。每个稀释度重复2次。

1.3 数据处理

数据结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS17.0软件、OriginPro 8和皮尔森相关性系数对获得的数据进行分析。利用SPSS17.0软件中的LSD法对相关数据进行显著性分析，显著性水平为0.05。

2 结果与讨论

2.1 酸性电解水冰的主要理化特性

2.1.1 电解水冰保存过程中pH的变化 在图1中，随保存时间的延长，不同浓度电解水冰的pH值均有着明显的上升趋势，这与相关文献的结果相似[8，11]。造成这一现象可能是由于阴离子如Cl-和OCl-吸附在带正电荷的冰表面，从而导致pH值的增加[3]。0～6 h内，不同质量浓度间的pH值变化不显著；而6 h后，NaCl质量浓度≤1 g/L制备的电解水冰，其pH变化速率小于NaCl质量浓度＞1 g/L。另外由图1可发现，NaCl质量浓度为0.75、1 g/L制得的电解水冰随着时间的延长其pH值上升得较为缓慢。NaCl质量浓度为1.25、1.5、1.75 g/L制备的电解水冰在0～6 h，其pH值上升也较为缓慢，且其pH在6 h时仍保持较低的值（pH 2.2）；而在6～10 h时其pH值上升较快，且pH值上升的幅度从2.2达到2.9。

图1 不同保存时间下电解水冰pH值的变化Fig.1 Changes in pH values of electrolyzed water ice under different storage durations

2.1.2 电解水冰保存过程中ORP的变化 Kim[12]和Liao[13]等研究表明，ORP是影响微生物失活的主要因素，因为它会损坏大肠杆菌的外膜和内膜，从而导致大肠杆菌失活。此外，研究表明，好氧性微生物适宜生存的ORP范围是200～800 mV。因此，探究电解水冰的ORP变化情况，对于电解水冰用于高效杀灭食源性致病微生物，具有重要意义。图2显示，不同质量浓度电解水冰的ORP随着时间的延长均逐渐下降，且ORP变化几乎全部遵循同一趋势；0～6 h这一时间段内，ORP下降较为缓慢，从1 150 mV下降到1 120 mV，下降的幅度范围为1.91%～4.74%；而6 h后其ORP下降速率明显快于6 h之前的ORP变化，从1 120 mV下降到1 000 mV，下降的幅度范围为7.85%～10.9%。

图2 不同保存时间电解水冰融化处理后ORP值的变化Fig.2 Changes in ORP values of electrolyzed water ice under different storage durations

2.1.3 电解水冰保存过程中ACC的变化 Abadias[14]等研究表明，ACC包括次氯酸（HClO）、次氯酸盐离子（OCl-）和氯（Cl2），是起到杀菌作用的主要因素。因此，探究电解水冰的ACC变化情况，对于电解水冰用于高效杀灭食源性致病微生物，同样具有重要意义。图3中，随着保存时间的延长，5种电解水冰的ACC均逐渐下降；NaCl质量浓度≤1.5 g/L电解水冰的ACC下降速率小于NaCl质量浓度＞1.5 g/L。NaCl质量浓度为0.75、1、1.25 g/L电解水冰随着时间的延长其ACC下降较为缓慢，且其ACC下降的幅度从 23 μg/g 到 5 μg/g， 减少了 18 μg/g；NaCl质量浓度为1.5、1.75 g/L随着时间的延长其ACC下降较快，且其ACC下降的幅度从75 μg/g到15 μg/g，减少了60 μg/g。因此，相对质量浓度较高的电解水冰ACC的损失率要大于相对质量浓度较低的电解水冰ACC损失率。

图3 不同保存时间电解水冰融化处理后ACC值的变化Fig.3 Changes in ACC values of electrolyzed water ice under different storage durations

2.2 酸性电解水冰对副溶血性弧菌的杀菌效果

图4表明，不同NaCl质量浓度的电解水冰在不同保存时间下对副溶血性弧菌的杀菌效果。NaCl质量浓度为0.75 g/L电解水冰对副溶血性弧菌的杀菌效果在 0～2 h 内没有显著性差异（p＞0.05），而其它不同NaCl质量浓度的电解水冰在不同时间下差异均显著（p＜0.05）。NaCl溶液质量浓度为0.75 g/L制备的酸性电解水冰，0 h时能杀灭菌落数为2.42 log（CFU/mL），随着时间的增加，电解水冰的杀菌能力有较大程度的降低，到第10小时时该酸性电解水冰的杀灭菌落数降低到0.66 lg（CFU/mL），降低了72.9%；质量浓度为1.25 g/L的NaCl溶液制成的酸性电解水冰，在0 h时可杀灭菌落数3.33 lg（CFU/mL），到第10小时其杀灭菌落数为1.37 lg（CFU/mL），降低了58.7%；质量浓度为1.5 g/L的NaCl溶液制成的酸性电解水冰，在0 h时可杀灭菌落数5.22 lg（CFU/mL），到第10小时其杀灭菌落数为2.35 lg（CFU/mL），降低了 54.9%。 以上结果表明，相对质量浓度较高电解水冰（AEW-ice 4，5）与相对质量浓度较低电解水冰（AEW-ice 1，2，3）相比，在同一环境条件下保存相同的时间，其仍具有较强的杀菌能力。

图4 不同保存时间电解水冰对副溶血性弧菌的杀菌效果Fig.4 Effects of electrolyzed water ice treatments on reducing Vibro.under different storage durations

对于同一时间不同质量浓度的酸性电解水冰杀菌效果分析可得，除保存0 h下NaCl质量浓度为1 g/L和1.25 g/L制备的电解水冰、保存2 h下 NaCl质量浓度为1 g/L和1.25 g/L制备的电解水冰以及保存8 h下NaCl质量浓度为0.75 g/L和1 g/L制备的电解水冰之间没有显著性差异（p＞0.05）外，其它时间相对应的不同质量浓度的酸性电解水冰杀菌效果均有显著性差异（p＜0.05）。不同保存时间条件下，电解水冰对副溶血性弧菌的杀菌效果随NaCl质量浓度的增加而增大。NaCl质量浓度为1.75 g/L的电解水冰在保存0 h下具有较强的杀菌能力，其杀菌数可达5.75 lg（CFU/mL）。将电解水冰的处理液进行涂布，结果发现未检出残存菌。因此，酸性电解水冰的处理液不会对环境造成二次污染，这一结果与相关文献[11，15]也是一致的。

在图4中，0～10 h处理时间内，相邻NaCl质量浓度为1.5 g/L及1.25 g/L的电解水冰对副溶血性弧菌的杀菌量差值，与其它所有相邻浓度间杀菌量差值相比较大，且最高比值可达117.6倍。结合电解水冰在保存过程中其pH值、ORP以及ACC的变化情况，可认为在此实验中，电解水冰较大幅度杀灭副溶血性弧菌的质量浓度转折点是1.5 g/L。

2.3 电解水冰的pH、ORP、ACC与杀菌量的相关性分析

图5表示1.5 g/L NaCl电解水冰的 pH、ORP、ACC以及杀菌数之间的相关性。结果表明：pH值、ORP和ACC与杀菌数之间相关系数r分别为0.831、0.787和0.944。三个理化指标均影响电解水冰对副溶血性弧菌的杀菌效果，而ACC对其杀菌效果的影响最大，与国内外关于电解水的一些相关研究报道的结果一致[3，16-18]。

图5 pH、ORP、ACC对电解水冰杀菌量的皮尔森相关性系数Fig.5 Pearson correlation coefficient of pH，ORP，ACC on inactivation of Vibrio Parahaemolyticus

不同的微生物对酸性环境的适应性是不同的，但一般来说，微生物生长过程中一般要求pH的适应范围为4～9。当pH在2.7以下时，大多数微生物都是不能生存的。这是因为微生物的表面结构中含有一些两性物质，当H+浓度较大时就会破坏这些结构成分，使细胞膜通透性增加，代谢过程受阻，最终导致死亡。另外，不同微生物其ORP的生存范围是不同的，好气性微生物的ORP范围为200～800 mV，嫌气性微生物的ORP范围为-700～1 000 mV。新制备的强酸性电解水冰其ORP值高达+1 100 mV，可改变细胞内电子流动，严重影响微生物的能量代谢与ATP的产生[19]。有效氯包括HClO、ClO-和氯的氧化物。电解质溶液中的Cl-在阳极被氧化为Cl2后形成HClO，HClO作为杀菌的前提物质，具有强氧化性，从而起到杀菌作用。

有关酸性电解水的主导杀菌因素（pH、ORP、ACC）方面的研究较多，并因此形成了几个主流学说，如高氧化还原电位杀菌学说、有效氯杀菌学说等[20]。国内王文清等[21]认为，酸性电解水杀菌以化学杀菌为主，其中有效氯浓度ACC为主要影响因素；以物理杀菌为辅，其中ORP值为主要影响因素；相关研究也表明，强酸性电解水的杀菌效果主要是其产生的氯气在起作用[5，22]。随着微酸性电解水生产装置的开发和杀菌效果研究的深入，有关微酸性电解水的主导杀菌因素，目前国内外比较认可有效氯中的次氯酸杀菌这一学说。但是对于酸性电解水的主导杀菌因素，人们更多地认为是酸性电解水的各个杀菌因素（包括 pH、ORP、ACC）协同作用的结果[23]。本研究结果表明，pH、ORP、ACC对电解水冰的杀菌效果均起到一定的作用。

实际应用中，特别是果品蔬菜贮藏保鲜方面[24]，为了取得更好的杀菌保鲜效果，可获得较高ACC的电解水冰，但高浓度的ACC可能对食品感官品质产生影响。因此需要在制备过程中选择合适的NaCl质量浓度进行制备。

3 结语

电解水冰是近年来发展的一种新型冷杀菌保鲜技术。作者对不同浓度酸性电解水冰的理化指标变化与其对食源性致病菌（副溶血性弧菌）杀灭情况间的关系进行研究，研究结果表明：不同质量浓度的NaCl溶液制备的电解水冰在相同贮存时间内，其理化指标的变化存在差异，且理化指标的变化与杀菌效果间存在一定相关性，其中ACC对菌杀灭影响最大，其次分别为pH、ORP。本研究结果为未来电解水冰在食品工业中应用于食品保鲜、延长货架期及降低食源性致病菌引起的食品安全风险方面提供参考数据。

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