重组大肠杆菌利用不同培养基发酵产琥珀酸的研究

华渤文，赵锦芳，王金华，肖子康，赵 筱

（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉430068）

琥珀酸（succinic acid），又称丁二酸，作为三羧酸循环的中间产物广泛存在于人体、动物、植物和微生物中[1]。琥珀酸是工业上一种重要的四碳化合物，广泛地应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆和塑料等行业[2]。同时，作为直链饱和二元羧酸，可以比较容易的合成大量的化学物质，如1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚琥珀酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一[3]。目前，大部分工业上琥珀酸的生产方法主要为化学合成方法，但是用化学合成方法得到琥珀酸，需要消耗大量不可再生的化石原料，并且具有转化率低，易污染环境等弊端。微生物发酵法生产琥珀酸由于其利用可再生资源，原料来源广泛，价格低廉，污染小，并且在发酵过程中固定CO2[4]，具有很好的应用前景，成为近些年的研究热点。琥珀酸的生产菌株很多，目前主要集中在琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）[5]、琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）[6-7]、产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens）[8]和重组大肠杆菌（Escherichia coli）[9]。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易进行代谢调控、操作简便和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究构建高产琥珀酸的工程菌株[10]。目前，利用廉价的可再生物质原料发酵生产琥珀酸受到许多研究者的亲睐，Liu等[11]利用Actinobacillus succinogenes CGMCC1593以经过预处理的甘蔗糖蜜作为原料，摇瓶厌氧发酵后琥珀酸的产量和生产强度分别为50.6g/L和0.84g/（L·h），分批发酵得到更高的产量和生产强度，分别为55.2g/L和1.15g/（L·h）。Agarwal等[12]利用甘蔗糖蜜和玉米浆作原料，大肠杆菌在摇瓶发酵36h积累琥珀酸7.1g/L，在发酵罐中通过控制发酵液的pH以及持续通入CO2，30h后积累琥珀酸17g/L。Wang等[13]构建了重组菌株Escherichia coli SD121，利用玉米秸秆水解液采取两阶段发酵产琥珀酸，最终产量和产率分别为57.81g/L和0.87，这是首次报道大肠杆菌工程菌利用玉米秸秆水解液产琥珀酸，并且从玉米秸秆高转化得到琥珀酸，展示了大肠杆菌利用可再生的生物质原料发酵产琥珀酸的强大潜力。葡萄糖结晶废糖液和玉米浆是玉米加工厂的副产物，具有廉价的优点，本研究以本实验室构建的高产琥珀酸工程菌Escherichia coli WS100为研究对象，考察其在玉米浆培养基和NBS培养基中的发酵特性，为高效、低成本琥珀酸工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

E.coli WS100 由本实验室构建得到；葡萄糖结晶废糖液（以下简称废糖液）、玉米浆 某玉米淀粉产葡萄糖加工厂，废糖液的糖浓度为500g/L（全部为葡萄糖），玉米浆含氮为1%，含乳酸11.76g/L；琥珀酸、乳酸、乙酸、甲酸的标准品 购自Sigma公司；其余试剂 均为国产分析纯或生化试剂，购于国药集团化学试剂有限公司；种子培养基 NBS培养基[14]加2%葡萄糖；发酵培养基 NBS培养基（（NH4）2HPO3作为氮源，添加葡萄糖作为碳源）和玉米浆培养基（玉米浆作为氮源，添加废糖液作为碳源以及WB生长促进剂），初始糖浓度均为60g/L。

超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司；高压灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温摇床、恒温振荡培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；移液器 德国Eppendorf公司；7L发酵罐 Sartorius Stedim，Biotech GmbH 37070，Gottingen Germany；高效液相色谱仪 美国戴安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 种子培养：从平板挑取单菌落至装有200mL种子培养基的500mL三角瓶中，置于37℃摇床，200r/min培养22h。

分批补料发酵培养：将种子液以5%的接种量接入装有4L培养基的7L发酵罐中，初始葡萄糖浓度为60g/L。整个过程37℃恒温厌氧发酵，搅拌转速为300r/min，通过自动流加3mol/L KOH和1.5mol/L K2CO3的混合溶液控制pH维持在7.0左右。发酵过程中补料2次，每次补加30g/L的葡萄糖溶液（或废糖液），累计补加120g/L葡萄糖（或废糖液）。

1.2.2 生物量的检测 生物量以600nm处的吸光度来表示（OD600）。采用可见分光光度计测定菌体细胞在600nm波长下的吸光值OD600，稀释相应倍数，使测得的OD值在0.8以下。

1.2.3 发酵产物分析 发酵液中的葡萄糖和有机酸的测定采用高效液相色谱法。高效液相色谱仪Dionex Ultimate 3000反相HPLC，色谱柱为Bio-Rad HPX 87H，VWD-3100双光束可变波长紫外可见检测器；流动相：4mmol/L H2SO4（pH2.5）；流速：0.5mL/min；进样量：20μL；紫外检测器检测，柱温：35℃。

琥珀酸的质量收率定义为：每消耗1g葡萄糖所能产生的琥珀酸的克数；琥珀酸的生产强度为每升发酵罐有效装液量每小时产琥珀酸的克数；糖利用率定义为消耗的糖占初始糖的百分比。

2 结果与讨论

2.1 E.coli WS100在NBS培养基中的发酵特性

由图1可以看出，在厌氧条件下，菌体生长非常迅速，4h进入对数生长期，23h时菌体浓度达到最大，OD600为7.63。菌体在35h开始进入稳定期，OD值保持在5～6之间。在耗糖方面，由于在对数生长初期，前8h耗糖速度比较缓慢；8～23h，菌体消耗葡萄糖的速率持续增大，反映了菌体能很好地利用葡萄糖生长，为大量发酵产生琥珀酸创造了优越的条件，发酵过程采用分批补加葡萄糖，两次分别补加30g/L的葡萄糖（发酵液中葡萄糖浓度）溶液，控制葡萄糖浓度在50g/L以下，整个过程累计添加葡萄糖120g/L，菌体在83h内消耗葡萄糖110.30g/L，耗糖速率为1.33g/（L·h）。

图1 WS100在无机盐基中的发酵特性Fig.1 Fermentation of WS100 in NBS medium

发酵液中初糖浓度为60g/L，在开始阶段，菌体密度小，葡萄糖消耗少，菌体的产物也很少，菌体进入对数生长期后，葡萄糖消耗的速率增大，琥珀酸不断积累，到达稳定期后，大量的菌体发酵积累琥珀酸，如图1所示，发酵液中主要代谢产物为琥珀酸，有少量乙酸、甲酸和乳酸生成，分批补料发酵83h，琥珀酸的产量为84.98g/L，琥珀酸生产强度为1.02g/（L·h），其他副产物乙酸为9.34g/L，甲酸为3.62g/L，乳酸仅为0.86g/L，整个发酵过程，琥珀酸的质量收率为77.04%。

2.2 E.coli WS100在玉米浆培养基中的发酵特性

发酵液初始葡萄糖浓度同样为60g/L，以玉米浆作为氮源，玉米浆浓度为20g/L，从图2中可以看出，菌体发酵初始阶段消耗葡萄糖的速率大，这是因为玉米浆中含有许多有机氮源，营养丰富，有利于菌体生长繁殖，因此使得发酵液中菌体浓度大，消耗葡萄糖的量多。发酵过程采用分批补加废糖液，两次分别补加含30g/L葡萄糖（发酵液中葡萄糖浓度）的废糖液，控制葡萄糖浓度在50g/L以下，83h内累计添加含120g/L葡萄糖（发酵液中葡萄糖浓度）的废糖液，整个厌氧发酵过程菌体耗糖量和耗糖速率分别为96.17g/L和1.16g/（L·h）。如图2所示，发酵液中主要代谢产物为琥珀酸，含有少量的乳酸和乙酸，无甲酸产生。发酵83h时，发酵液中琥珀酸的产量为63.45g/L，琥珀酸的生产强度和质量收率分别为0.76g/（L·h）和65.98%，其他杂酸：乙酸为2.96g/L，乳酸积累9.36g/L，由于玉米浆中含有乳酸，初始培养基中乳酸浓度为4.02g/L，所以菌体产生乳酸的产量为5.34g/L。

图2 WS100在玉米浆培养基中的发酵特性Fig.2 Fermentation of WS100 in corn steep liquor medium

2.3 E.coli WS100在两种培养基中发酵情况的比较

由表1可以看出，0～12h，菌体在玉米浆培养基中消耗葡萄糖的速率明显大于在NBS培养基中的，在玉米浆培养基中，菌体消耗20.64g/L葡萄糖，而在NBS培养基中，菌体仅消耗9.65g/L葡萄糖，菌体在玉米浆培养基中的耗糖速率是在NBS培养基中的2.15倍。12h之后，菌体在玉米浆培养基中消耗葡萄糖量小于在NBS培养基中的，在添加相同浓度葡萄糖的情况下，发酵83h时，NBS培养基中残糖量仅为9.7g/L，而玉米浆培养基中的残糖量为23.83g/L。整个发酵过程中，菌体在NBS培养基耗糖速率为1.33g/（L·h），在玉米浆培养基中为1.16g/（L·h）。

菌体在两种培养基中的发酵主要产物均为琥珀酸，但是琥珀酸的积累不同，如表1所示，前12h，菌体在NBS培养基中积累琥珀酸8.41g/L，在玉米浆培养基中却能积累琥珀酸15.42g/L。整个发酵过程中（0～83h），菌体在NBS培养基中琥珀酸的产量比在玉米浆中多21.53g/L，表明NBS培养基比玉米浆培养基更有利于菌体发酵产琥珀酸，乙酸在玉米浆培养基发酵液中的产量比在NBS培养基中少6.38g/L，玉米浆培养基发酵液中乳酸的产量比在NBS培养基中多4.48g/L，NBS培养基发酵液中甲酸的产量为3.62g/L，而玉米浆培养基发酵液中没有甲酸积累。发酵产物均为HPLC检测，液相图谱如图3所示，图3（A）为NBS培养基83h发酵液的出峰情况，图3（B）为玉米浆培养基83h发酵液的出峰情况。

图3 发酵液的HPLC图谱分析Fig.3 HPLC profiles analysis of fermentation products

3 结论

本研究对Escherichia coli WS100分别在NBS培养基和玉米浆培养基中进行发酵实验，表明玉米浆和葡萄糖结晶废糖液可以发酵产琥珀酸，琥珀酸产量为63.45g/L，琥珀酸的生产强度和质量收率分别为0.76g/（L·h）和65.98%，在NBS培养基中琥珀酸的产量更高，达到84.98g/L，另外琥珀酸的生产强度和质量收率都优于在玉米浆培养基中的，分别为1.02g/（L·h）和77.04%。

表1 WS100在不同培养基中耗糖情况和发酵产物的比较Table 1 Comparison of consumption of sugar and products by WS100 in different medium

尽管如此，本研究中WS100在玉米浆培养基中积累琥珀酸的产量在国内处于领先水平。本实验采用分批补料发酵的操作方式，较好地避免了糖浓度过高对菌体的抑制作用，提高了WS100发酵产琥珀酸的效率。实验采用的玉米浆和废糖液是一种廉价的可再生的原料，更能够显著体现发酵可以不与人争粮、不与人争地的优点，是一种有工业应用前景的琥珀酸发酵的原料。本实验室今后的研究着重于培养基和发酵条件的优化，增加WS100在玉米浆培养基中积累琥珀酸的产量，降低琥珀酸的生产成本，使廉价的玉米浆和废糖液能代替无机盐和葡萄糖制备琥珀酸成为可能。

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