无患子总皂苷质控品的制备

伍 恒，张 翠，翁 震，徐德平，汪何雅，姚卫蓉

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214000；2.福建源华林业生物科技有限公司，福建三明354500）

无患子又名肥皂树，其果皮中含有丰富的无患子皂苷，是一种天然的非离子型表面活性剂，具有很强的降低表面张力的作用，泡沫丰富、手感细腻、去污力强。用从无患子果提取的皂苷制得的皂乳洗碗剂、蔬果清洗露、食品机械清洗剂等用于食品工业中不会带来萤光剂、表面活性剂、人工激素、江河湖泊富营养化等负面问题，在一定程度上保证了食品安全；另外，无患子皂苷还能迅速分解，不会对环境造成任何污染。目前，国内对无患子皂苷的研究仍处于初步阶段，市面上没有无患子皂苷的纯品出售，关于其定性研究比较困难。关于皂苷的测定方法较多，主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相-质谱联用法、气相色谱法、高效毛细管电泳法等，以上分析方法各个侧重点不同：比色法、紫外分光光度法比较适用于检测总皂苷含量；薄层色谱法在中药成分研究中应用较为广泛；高效液相色谱法对于皂苷的定量检测较方便，但需要昂贵的标准品做对照[1-2]；液质联用法能高效准确地对皂苷定性和定量[3-8]，但设备仪器价格昂贵，操作技术要求高。分光光度法已经应用于人参总皂苷、酸枣仁皂苷、黄芪总皂苷等的测定中，证明了该方法是检测总皂苷含量的方便有效地方法之一。

所以本文采用醇提-大孔树脂吸附法自制无患子总皂苷标准品，经Libermann-Buehard反应、溶血反应定性，并采用HPLC/MS方法初步鉴定无患子总皂苷成分，经香草醛-冰醋酸比色法定量无患子总皂苷标准品纯度。目前市面上涌现出越来越多的无患子皂苷产品，例如无患子蔬果清洁露、无患子洗碗露等，所得高纯度皂苷可作为工艺研究的质量控制标准品，同时也可作为食品工业上无患子皂苷产品中皂苷含量检测的标准品。填补了市面上没有高纯度无患子总皂苷出售的空白，为进一步实验研究打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无患子果皮 福建源华生物科技有限公司；95%乙醇、石油醚、正丁醇、香草醛、高氯酸（70%～72%）、冰醋酸、浓硫酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；AB-8大孔树脂 天津南开大学化学工厂；MCIgelCHP20P（75～150μm）柱填料 日本三菱化成公司；GF254薄层硅胶板 山东烟台芝罘化工厂；齐墩果酸标准品 中国药品生物制品检定所；日本大耳白兔 北京百尔康纳特实验兔繁育生物技术开发有限公司。

可调试移液器 Thermo Labsystems公司；PL2002型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GEN-14型电动微型粉碎机 四川自贡渐飞机械厂；W501型恒温水浴锅 上海申顺生物科技有限公司；CQ-88-205型萃取罐 常州市特威电气自动化系统有限公司；TU-1900型双束紫外可见分光光度计 日本岛津公司；Waters Synapt G2型超高效液相色谱-质谱联用仪 美国Waters公司；R-501型旋转蒸发器上海申顺生物科技有限公司；SHBⅢ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 无患子总皂苷质控品的制备

1.2.1.1 无患子粗皂苷的提取 将无患子果皮磨碎成20目左右，称取5kg无患子粉末于提取罐中，加15kg 70%乙醇75℃下提取3h。将第一次提取液经8层纱布过滤从罐底放出。滤渣留在提取罐中进行第二、三次提取，酒精浓度、酒精用量、提取时间和温度与第一次提取相同，合并三次滤液并离心。采用旋转蒸发仪蒸发回收乙醇至浸膏状。

1.2.1.2 无患子总皂苷的分离 将上述浸膏状无患子粗皂苷分散至石油醚中萃取3次，弃去石油醚层，水相部分用正丁醇萃取5次，至正丁醇相几乎没有颜色，合并正丁醇相，减压浓缩，加入适量蒸馏水，水溶液中加入5%Ca（OH）2混匀，放置2h使沉淀，去除粘液质、鞣质和部分黄酮，抽滤后得到无患子粗皂苷溶液继续上AB-8大孔树脂柱，流速约15mL/min，上样量应低于柱体积的1/4。大孔树脂预处理、装柱及再生方法见文献[9]。先用蒸馏水洗脱去除糖类、氨基酸、色素等水溶性杂质，再用70%乙醇洗脱得无患子粗皂苷液，取出一部分干燥成粉末，HPLC-MS分析其成分。

1.2.1.3 无患子总皂苷的纯化 将大孔树脂分离所得无患子粗皂苷液浓缩，再加水稀释至浓度约5%的水溶液，上样MCI（聚苯乙烯基的反相树脂填料）凝胶柱，分别用蒸馏水、30%、70%乙醇洗脱，减压浓缩干燥得混合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，HPLC-MS、泡沫实验、TLC检测、Libermann-Buehard反应、溶血性实验同步进行定性分析。

1.2.2 无患子皂苷的定性测定

1.2.2.1 HPLC-DAD/MS检测条件 配制1mg/mL无患子粗皂苷液（大孔树脂70%洗脱部分），进行HPLCDAD/MS检测。检测条件[10-11]如下：色谱柱为BEC C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流动相A：甲醇，流动相B：水，起始时40%A，60%B；20min时80%A，20%B；25min时100%A，流速0.3mL/min，柱温45℃，进样量5μL。ESI离子源；正离子模式与负离子模式相互验证，MRM多反应监测，雾化N2压力为275.8kPa，干燥N2流速9L/min，温度为350℃，毛细管电压为3.0kV，质量范围100～3000m/z，脱溶剂气温度250℃，离子源温度120℃，DAD范围190～400nm进行扫描。无患子皂苷正负离子流色谱图见图2、图3。

1.2.2.2 Libermann-Buehard反应 组分Ⅲ粉末1mg，加乙酸酐溶解，随后再加入乙酸酐-浓硫酸（1∶20）数滴，振摇[12]。观察颜色变化，颜色的变化为黄-红-紫-蓝，显示可能有三萜皂甙。

1.2.2.3 溶血反应 溶血反应是皂苷的特征反应，皂苷能导致血细胞破裂，因此可以利用溶血性来判断样品中是否含有皂苷。取大耳兔新鲜血液20mL，放入加有玻璃珠的三角瓶中，振摇10min除纤维蛋白后转至刻度离心管中，加生理盐水10mL混匀后1500r/min离心5min，除去上清液，再加适量生理盐水离心，重复至上清液无色澄清。弃去上清液取2mL红细胞，加入98mL生理盐水，即配成2%的红细胞悬浮液，备用[13]。配制混合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ水溶液1mg/mL，取试管4支，分别加入滤液0.25、0.5、0.75、1mL，然后依次分别加入生理盐水2.25、2.0、1.75、1.5mL，使每一个试管中的溶液均为2.5mL，再将各试管加入2%的血细胞悬液2.5mL，振摇均匀后，立即置于37℃水浴中温浴3h，以1500r/min离心5min，若实验溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或少量残留，表明有溶血反应；若细胞全部下沉，上清液无色透明，表明无溶血现象发生[14]。

1.2.3 无患子总皂苷纯度鉴定

1.2.3.1 齐墩果酸标准曲线制备 根据HPLC-MS分析结果，无患子总皂苷主要为齐墩果酸型三萜皂苷，所以选择齐墩果酸作为无患子总皂苷元的标准品。齐墩果酸用甲醇溶解，配制成1mg/mL的溶液，取18支20mL比色管，编号1～6，每个编号三组平行，1～6号试管分别取0、200、400、600、800、1000μL齐墩果酸标准溶液，水浴挥干。每管加入0.4mL 5%（wt%）香草醛-冰醋酸溶液和1.4mL高氯酸溶液为显色剂，摇匀，在70℃水浴加热20min，冰水浴中冷却3min，加入10mL冰醋酸为溶剂，摇匀，用分光光度计在400～600nm扫描光谱，并在550nm测吸光度[15]。

1.2.3.2 无患子总皂苷水解条件的确定 浓盐酸水解法是通过皂苷经水解后得到皂苷元，再经换算得到相应皂苷的含量。无患子皂苷根据文献[16]对于酸种类、酸浓度及水解时间都有一定的研究，但关于水解方式的比较方面报道甚少。本实验比较了三种不同的水解方式：回流加热、100℃水浴、高温高压。方法如下：

待测样品的配制：精密称取无患子总皂苷粉末1g，加33mL水溶解后，再加入17mL浓盐酸使盐酸浓度达到35%左右。

（a）回流加热：组装实验室常用的回流冷凝装置，将上述待测样品置于100mL圆底烧瓶中，用油浴锅在100℃回流加热2h；

（b）100℃水浴：将上述待测样品置于100mL锥形瓶中，加硅胶塞密封，用水浴锅在100℃加热2h；

（c）高温高压：将上述待测样品置于100mL锥形瓶中，加硅胶塞密封，用高压蒸汽灭菌锅在120℃，0.1MPa加热2h。

将以上三种水解方式的产物用三氯甲烷振摇提取三次，合并提取液，回收溶剂至干，甲醇定容后待测定。

1.2.3.3 无患子总皂苷与齐墩果酸量比换算系数 齐墩果酸的分子式C30H48O3，分子量为456，按含量加权分析[17]推断无患子总皂苷的平均分子量为882.5，与齐墩果酸的分子量在理论上的量比系数为1.94，考虑在无患子总皂苷水解过程中不能达到完全水解，无患子总皂苷元的得率有所损失，皂苷元最大得率达85%左右[18-19]，所以量比系数1.94除以85%即为加权系数2.3，无患子总皂苷含量的计算公式为：

无患子总皂苷的含量=试样中齐墩果酸相当量（μg）×2.3

2 结果与分析

2.1 大孔树脂分离所得无患子粗皂苷液成分鉴定

图1 无患子粗皂苷液的ESI检测总离子流色谱图Fig.1 ESI-total ion chromatograms of TSS

一般三萜皂苷类化合物的紫外吸收很弱，通过高效液相-紫外检测（HPLC-UV）或高效液相-蒸发光散射（HPLC-ESCD）测定其含量较困难，且需要较昂贵的对照品。HPLC-MS检测三萜皂苷类物质灵敏度高，并能提供每个谱峰的分子量及结构信息，在没有对照品的情况下，可以快速鉴定出三萜皂苷类成分。本研究首先采用大孔树脂初步分离纯化得无患子粗皂苷液，为了判断所得无患子粗皂苷液中的成分，选择正离子和负离子两种模式同步进行无患子粗皂苷的ESI-MS检测，正、负离子模式下无患子粗皂苷成分总离子流色谱图如图1所示，可以看出其单体成分较多，很难完全分离，对主要色谱峰进行编号，编号为1～15。

正离子ESI-MS谱中出现各皂苷成分的[M+Na]+准分子离子峰，负离子ESI-MS谱中则为[M-H]-和[M+Cl]-准离子峰。通过正、负离子质谱相互验证，因为各单体很难完全分离，所以质谱图中会有一些碎片离子干扰，但主要的碎片离子可以较易从图中读出，并在相应的碎片离子上标明[M+Na]+、[M-H]-、[M+Cl]-，从而初步判断无患子粗皂苷中主要单体的分子量，根据相关书籍[20]，初步推测无患子粗皂苷液中主要成分，结果见表1。

根据质谱元素分析软件Mass Lynx V4.1，可以初步判断分子量1188、1086、1400为含氮或含硫化合物，属于杂质成分；6号组峰分子量均为1190，该类物质王晓淳等[21]报道其性质不稳定，很难分离得到纯品，结构难以鉴定；8号组峰主要是分子量为1086与1232的混合峰，很难分开；分子量为1044和1128的物质至今未见报道；分子量为1000、1002、1146、1148、1232的物质属于倍半萜糖苷类化合物；分子量为1206、1074、882、750、924、966的物质为三萜皂苷类化合物，杨运云等[22]对复方毛冬青冲剂中三萜皂苷活性成分进行分析，报道了齐墩果酸型及乌索烷型三萜皂苷在一级正离子质谱图中均有m/z437特征离子，上述无患子三萜皂苷正离子ESI-MS中均有特征碎片峰m/z437，结果与杨运云等的报道相似，进一步确定了分子量为1206、1074、882、750、924、966为三萜皂苷，且主要为齐墩果酸型三萜皂苷。结合图3和表1可知，4～10min出峰的主要是倍半萜糖苷类物质，10～20min出峰的主要为三萜皂苷类物质，且主要有8种三萜皂苷单体，这与Huang等[23]和Saxena等[24]报道的10～20min出现约7个三萜皂苷单体的报道相似。综上所述，要得到纯度较高的皂苷成分，还需要进一步分离，将倍半萜糖苷类物质去除。

2.2 无患子总皂苷进一步纯化

图2 TLC同步检测MCI柱分离结果Fig.2 The result of separation of MCI GEL by TLC detection

2.2.1 TLC同步监测MCI柱分离结果 根据不同物质在MCI柱上的吸附力不同，先用蒸馏水洗脱直至用薄层板检测无检出物，这部分合并即为组分Ⅰ；用30%乙醇洗脱至薄层板上无检出物，合并洗脱液成组分Ⅱ；再用70%乙醇洗脱直至无目标物，合并洗脱液得组分Ⅲ，根据洗脱物保留时间不同可知组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是三类不同极性的物质。

表1 无患子粗皂苷成分分析Table 1 Analysis of components of the total sapindus-saponins

2.2.2 HPLC-MS检测组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 结合表1所鉴定的无患子粗皂苷成分，编号对应图3。根据分子量及出峰时间可以推断无患子总皂苷主要集中在组分Ⅲ中，主要成分如下（括号内为分子量）：Sapindoside B（882）、Sapindoside A（750）、Mukurozi-saponin E1（924）、Sapindoside L（924）、Mukurozi-saponin G（966）、Sapindoside M（966）；组分Ⅱ中也含有少量无患子三萜皂苷，分别为Mukurozi-saponinY（1206）和MukurozisaponinX（1074），出峰时间为10.02min，但因为其含量较少，且从组分Ⅱ中完全分离比较困难，所以本实验未对组分Ⅱ进行进一步分离，组分Ⅲ即为本实验所需无患子总皂苷质控品，且根据峰面积可知组分Ⅲ中无患子总皂苷含量较高。

图3 组分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的ESI检测负离子流色谱图Fig.3 ES-ion chromatograms of mixtureⅠ，Ⅱ，Ⅲ

2.2.3 组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ性能验证 经Libermann-Buehard反应及溶血实验，发现组分Ⅰ、Ⅱ的Libermann-Buehard反应无颜色变化，在较高浓度（0.3mg/mL）仍无溶血反应，说明几乎不含皂苷或皂苷含量较少，这与HPLC-MS推测的结果一致；组分Ⅲ有明显的皂苷的特性，Libermann-Buehard反应颜色由黄-红-紫-蓝，且在较低浓度（0.02mg/mL）时仍有溶血性，说明三萜皂苷含量较高，进一步断定组分Ⅲ即所需无患子总皂苷质控品。

2.3 无患子总皂苷纯度的判定

通过MCI柱分离可知，组分Ⅲ为纯度较高的无患子总皂苷，因为其含有相同的齐墩果酸型皂苷元，结构相似，所以很难完全分离开，无法用面积归一化法对其进行纯度的计算。根据文献[25]，通过将皂苷水解为皂苷元，再经过加权系数分析，可以计算皂苷的含量。

图4 齐墩果酸在香草醛-冰醋酸体系中紫外吸收Fig.4 The UV graph of olenolic acid in vanilin-acetic-HClO4system

2.3.1 齐墩果酸标准曲线 齐墩果酸通过香草醛-冰醋酸显色后在400～600nm扫描，可知在550nm左右有最大吸收。以齐墩果酸为无患子三萜皂苷元的标准品，得回归方程如下：y=0.0006x+0.0838，R2=0.9996，其中，x为齐墩果酸含量，y为吸光度。齐墩果酸含量在200～1000μg范围内与吸光度呈现良好的线性关系，可作为齐墩果酸型皂苷元质量评价的标准曲线。

2.3.2 无患子总皂苷水解后的吸收特征 无患子总皂苷经过水解得到皂苷元，经过香草醛-冰醋酸显色后，在550nm左右处有最大吸收，这与齐墩果酸标准品的最大吸收峰一致，进一步说明了该三萜皂苷元为齐墩果酸型皂苷元。

图5 无患子皂苷元在香草醛-冰醋酸体系中紫外吸收Fig.5 The UV graph of sapindus-sapogenin in vanilin-acetic acid-HClO4system

2.3.3 无患子总皂苷水解条件的确定 从表2可以看出，当盐酸浓度35%，水解2h时，高温高压方法下皂苷元得率最高，通过1.2.3.3的换算方法可知无患子总皂苷的纯度可达95.2%。

表2 无患子皂苷水解条件的确定（n=3）Table 2 Comparation of hydrolysis conditions of the total sapindus-saponins（n=3）

3 结论

通过乙醇提取，石油醚除杂，正丁醇萃取，AB-8大孔树脂，MCI凝胶柱分离纯化得无患子总皂苷，鉴定主要为齐墩果酸型三萜皂苷，纯度可达95.2%，可作为无患子总皂苷质控品。无患子皂苷是一类结构相似的混合物，由于其具有多样性与复杂性，单个皂苷分离十分困难，关于无患子皂苷的化学组成的研究一直是一大难题。本文的研究内容为进一步分离无患子皂苷单体奠定了坚实的基础。

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