葡萄籽口含片的制备

巫春宁 林向阳 王长春 郑为东 叶南慧 吴 佳

WU Chun-ning LIN Xiang-yang WANG Chang-chun ZHENGWei-dong YE Nan-hui WU Jia

（福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108)

(College of Biology Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou,Fujian 350108,China)

原花青素（proanthocyanidins，PC）是天然植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，属于植物多酚类物质[1]。原花青素水溶性好，极易被机体吸收，生物利用度高达90%以上，是目前为止所发现的最强的抗氧化剂和自由基清除剂，其在体内抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍[2,3]。

早期的原花青素原料主要来源于松树皮，后来发现从葡萄籽中提取的原花青素纯度更高、质量更好、功效更强，因而成为国际市场上生产原花青素的最主要原料。在欧美发达国家，以葡萄籽提取物——原花青素为主要原料膳食补充剂已被广泛利用多年，人们每天补充或者使用葡萄籽提取物（原花青素产品）已经形成一种良好的生活习惯，就如同每天补充维生素一样。

葡萄籽是葡萄酒厂的下脚料，经晒干后分离葡萄皮、葡萄梗后所得产物。葡萄籽含有丰富的各种氨基酸、维生素及矿物质等。据中商情报网[4]数据统计，2011年1～12月，中国葡萄酒的产量达11.6亿L，而葡萄籽作为葡萄酒行业的主要副产品，每年的产量都非常可观，而且最近几年在逐步递增，为此，可以充分利用这部分资源创造高附加产值。通过超声波辅助提取葡萄籽中的原花青素，再将其浓缩，冷冻干燥成粉状，作为片剂主成分，辅以甘露糖及羟丙甲纤维素（HPCM）等，经混合、造粒、干燥、压片等工序，制成了低热量、具有保健功能的口含片。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄籽：安徽毫州公司；

原花青素标准品：阿拉丁试剂有限公司；

阿斯巴甜：常茂生物化学工程股份有限公司；

羟丙甲纤维素（HPCM）：安徽山河药用辅料有限公司；

药用滑石粉：广西桂林市海达滑石制品有限公司；

聚乙二醇：湖南华日制药有限公司；

微晶纤维素：安徽山河药用辅料有限公司；

β-环糊精：孟州市华兴生物化工有限责任公司；

香草醛、盐酸、乙醇、甲醇等：均为分析纯，市售。

1.2 仪器与设备

三频数控超声波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超市仪器有限公司；

紫外分光光度计：UV-1100型，上海美谱达仪器有限公司；

单冲压片机：TDP-1.5型，中南制药机械厂；

冷冻干燥机：FD5-series型，西盟国际集团；

低速离心机：SC-3612型，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

电子天平：BL150型，德国赛多利斯集团；

低热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏实验设备有限公司；

旋转蒸发仪：N-1001型，上海爱明仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄籽中原花青素含量的测定 采用香草醛—盐酸法[5]。

1.3.2 样品中原花青素提取率的计算 取一定量葡萄籽粉，用乙醇进行超声波浸提后，于离心机4 000 r/min离心20 min，取0.5 mL上清液，稀释1倍，测定其吸光度。通过标准曲线计算提取液中原花青素的含量，并按式(1)计算其提取率。

式中：

R——原花青素提取率，%；

V——提取液体积，mL；

m——每毫升提取液（稀释后）中原花青素的量，mg；

M——葡萄籽质量，g。

1.4 原花青素提取工艺优化

1.4.1 超声波频率对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g过30目筛的葡萄籽，固定乙醇浓度60%，料液比1∶10(m∶m)，温度40℃，提取时间20min，超声波功率240W，考察不同超声波频率（40，80，100 kHz）对葡萄籽提取率的影响。

1.4.2 物料目数对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g粉碎葡萄籽，固定乙醇浓度60%，料液比1∶10(m∶m)，温度40℃，提取时间20 min，超声波功率240W，超声波频率80 kHz，考察过不同目数（20,30,40,50,60）的葡萄籽粉末对葡萄籽提取率的影响。

1.4.3 乙醇浓度对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g过30目筛的葡萄籽，固定料液比1∶10(m∶m)，温度40℃，提取时间20min，超声波功率240W，超声波频率80 kHz，考察不同乙醇浓度（35%，45%，55%，65%，75%，85%，95%）对葡萄籽提取率的影响。

1.4.4 超声波功率对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g过30目筛的葡萄籽，固定乙醇浓度60%，料液比1∶10(m∶m)，温度40 ℃，提取时间 20min，超声波频率 80 kHz，考察不同超声波功率（120，150，180，210，240，270，300W）对葡萄籽提取率的影响。

1.4.5 提取温度对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g过30目筛的葡萄籽，固定乙醇浓度60%，料液比1∶10(m∶m)，提取时间20min，超声波功率240W，超声波频率80 kHz，考察不同温度（25，35，45，55，65，75 ℃）对葡萄籽提取率的影响。

1.4.6 提取时间对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g过30目筛的葡萄籽，固定乙醇浓度60%，料液比1∶10(m∶m)，提取时间20min，超声波功率240W，超声波频率80 kHz，考察不同时间(10，20，30，40，50，60min)对葡萄籽提取率的影响。

1.4.7 液料比对原花青素提取率的影响 准确称取2.00 g过30目筛的葡萄籽，固定乙醇浓度60%，温度40℃，提取时间20min，超声波功率240W，超声波频率80 kHz，考察不同料液比质量比分别为(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25)对考察葡萄籽提取率的影响。

根据预试验结果，分析超声波频率、物料目数、提取溶剂（乙醇浓度）、超声波功率、提取温度、时间、料液比等因素对指标（原花青素提取率）的影响，选出对其影响最显著的因素，再采用中心组合设计（CCD）进行响应面试验分析。

1.5 提取液的处理及压片

利用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩后，再冷冻干燥，得粉末状提取物，再将其运用到含片中。以感官评定标准（表1）为指标，探究辅料种类、配比对葡萄籽含片组织状态、风味、口感、硬度、色泽的影响。

表1 口含片感官质量评分标准Table1 Marking standards about sensory evaluation of tablet

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果

2.1.1 响应面试验结果及方差分析 在单因素及综合分析基础上，择优选取乙醇浓度、温度、时间进行RSM三因素三水平试验，因素水平表见表2，响应面试验结果见表3。

表2 响应面因素与水平表Table2 Factors and levels of RSM

2.1.2 模型的建立及方差分析 由表4可知，试验数据所得模型的F值为22.90，模型P<0.000 1，表示该模型极其显著。失拟项的F值为0.78，P值为0.602 0不显著，表明该方程拟合性好，可用回归方程来预测实际的试验结果。

由表5可知，该模型对超声波提取葡萄籽中原花青素进行分析和预测对实践具有指导意义。由模型拟合得到的编码响应面二次回归模型R=+2.49-0.17A+0.019B+0.081C-0.019AB+0.057AC-0.027BC-0.21A2-0.088B2-0.10C2，其方程R2为0.953 7。通过求方程极值得到的最优提取工艺：乙醇浓度71.25%，温度46.08℃，时间42.74 min，最大预测值为2.534%。

2.1.3 试验因素及交互作用对原花青素提取率的影响

(1)乙醇浓度、温度及其交互作用对原花青素提取率的影响：由图1可知，在提取时间40min条件下，当提取温度为35℃时，原花青素提取率随着乙醇浓度的上升而增大，当达到一定值后，又下降，这主要是因为原花青素易溶于极性溶剂，但达到一定限度时，反而会随着溶剂极性的增强而降低。而当乙醇浓度为65%时，温度对原花青素提取率的影响呈较为平缓的趋势。

表3 响应面中心组合试验设计及结果Table3 Response surface central composite design arrangementand experimental results

表4 试验结果方差分析表Table4 Analysis of variance for the experimental results

表4 试验结果方差分析表Table4 Analysis of variance for the experimental results

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

变异来源模型A-乙醇浓度B-温度C-时间AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总值SS 1.29 0.39 4.971E-003 0.090 3.04E-003 0.026 5.724E-003 0.62 0.11 0.16 0.063 0.028 0.035 1.36 df 91 1 11 1 1 1 1 1 1 0 5 5 1 9 MS 0.14 0.39 4.971E-003 0.090 3.04E-003 0.026 5.724E-003 0.62 0.11 0.16 6.279E-003 5.519E-003 7.038E-003 F 22.90 62.39 0.79 14.38 0.48 4.10 0.91 98.65 17.70 24.70 0.78 P<0.000 1<0.000 1 0.394 5 0.003 5 0.502 2 0.070 3 0.362 2<0.000 1 0.001 8 0.000 6 0.602 0显著度********不显著

表5 模型可信度分析Table5 Analysis ofmodel reliability

(2)乙醇浓度、时间及交互作用对原花青素提取率的影响：由图2可知，在温度45℃条件下，当提取时间为20min时，原花青素提取率随着乙醇浓度的上升而增大，当达到一定值后，又下降。当乙醇浓度为65%时，原花青素提取率会随着提取时间的延长而提高，而后呈现略微下降趋势，当超声波时间较短时，原花青素不易溶出，原花青素提取率随提取时间的延长而增大，但超声时间过长一方面，耗时，另一方面提取液经长时间超声空化效应，增加了超声波作用强度，破坏了原花青素母核的结构，且导致温度升高，不利于原花青素的提取[6,7]。

(3)温度、时间及交互作用对原花青素提取率的影响：由图3可知，在乙醇浓度为75%条件下，当提取时间为20min时，原花青素提取率随着温度的上升而增大，当达到一定值后，又下降。当温度为35℃时，原花青素提取率会随着提取时间的延长而提高，而后呈平缓，略微下降趋势。

图1 乙醇浓度，温度及其交互作用对原花青素提取率的影响Figure 1 Effectof Concentration of ethanol,tempertature and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

图2 乙醇浓度，时间及其交互作用对原花青素提取率的影响Figure 2 Effectof Concentration of ethanol,time and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

图3 温度，时间及其交互作用对原花青素提取率的影响Figure 3 Effectof temperature,time and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

2.1.4 验证实验 根据响应面优化得到的最佳提取条件：乙醇浓度71.25%，温度46.08℃，时间42.74 min，在此条件下，进行验证实验。原花青素提取率为2.521%，相对于预测值2.534%，其相对误差为0.51%，充分验证了所建模型的正确性。

2.2 压片工艺

2.2.1 填充剂、黏合剂对含片质量的影响 由表6可知，甘露醇和乳糖的填充效果最佳，3%的HPCM的黏合效果最好。由于水易被物料迅速吸收，难以分散均匀，造成结块等现象，所制成的颗粒也松紧不匀而影响片剂的质量[8]；而用80%乙醇和8%淀粉浆，虽然效果会好些，但制成的颗粒粉末较多，颗粒大小分布不均匀,且操作过程中要迅速，以免醇挥发后，软材变硬或结块，影响制粒[9]。故综合考虑选用3%HPCM乙醇溶液作为黏合剂，进行压片。甘露醇在口腔含化过程中，有负热效应，故在口腔中溶解有清凉感，适用于口含片，但若选用单一的甜味剂，甜味较为单调，不够醇厚，再者甘露醇流动性较差而且价格较贵，故将甘露醇配合乳糖（4∶1）、矫味剂（阿斯巴甜）进行压片使用。

表6 填充剂、粘合剂对含片感官质量的影响Table6 Effectof filler and adhesive on aesthetic quality of tablet

2.2.2 润滑剂对含片质量的影响 休止角越小，说明颗粒具有更好的流动性，据表7可知硬脂酸镁的润滑效果最好，可以使含片的片重均匀，而且能减少粘冲现象，使含片表面光滑。从感官评定得分，知硬脂酸镁的添加较不会对含片口感产生影响，而加滑石粉制得的口含片口感较差，有苦味，而加聚乙二醇制成的片子脱膜效果好，但其本身有苦涩味，口感不佳[10-13]。

表7 润滑剂对含片感官质量的影响Table7 Effectof lubricanton aesthetic quality of tablet

2.2.3 干燥温度及时间对含片质量的影响 软材造粒后，要迅速干燥，否则易结块，影响后续的压片效果。因含片中葡萄籽提取物（主要成分原花青素），在高温下易氧化，而失去功效，且会造成软材中的糖分熔化，使颗粒容易结块、坚硬；而干燥温度过低，又将延长干燥时间，降低生产效率。由表8可知，造粒后置于烘箱中50℃干燥90min制得的含片颗粒紧凑，硬度合适，无裂片，碎片。

2.2.4 葡萄籽提取物的包合及配方研究 因葡萄籽提取物，有苦涩味，稳定性不好，故选用β-环糊精对葡萄籽提取物进行包埋，以此来掩盖其苦涩味。经前期试验，得出将0.45 g葡萄籽提取物置于45℃、50 g的β-环糊精饱和溶液中包埋42min，得到的包埋物口感效果好。而后考察包合物与填充剂的配比（总用量92%）情况，柠檬酸与阿斯巴甜配比(总用量2%)对含片配方的影响。

由表9可知，当包合物与填充剂配比为1∶3，柠檬酸与阿斯巴甜配比为1∶1时，得出的葡萄籽含片外形圆整(直径0.8 cm)，含片表面光滑，色泽均匀，入口顺滑，清凉爽口，酸甜适宜，每片重（0.27±0.03）g。

表8 干燥温度及时间对含片感官质量的影响Table8 Effect of drying temperature and time on aesthetic quality of tablet

表9 主辅配料对含片质量的影响Table9 Effectof ingredients on aesthetic quality of tablet

3 结论

(1)采用超声波辅助提取葡萄籽中的功能性成分——原花青素，通过单因素和响应面分析得出提取最佳工艺条件：乙醇浓度71.25%，温度46.08℃，时间42.74 min,在此条件下，原花青素提取率为2.521%，相对于预测值2.534%，其相对误差为0.51%，充分验证了所建模型的正确性。

(2)利用旋转蒸发仪将提取液进行浓缩后，于冷冻干燥机中干燥制成粉末，将其用于含片的制作，得出当包合物与填充剂配比1∶3（92%），柠檬酸与阿斯巴甜配比为1∶1（2%），3%HPCM的乙醇溶液（4.5%），硬脂酸镁为1%时，得出的葡萄籽含片（0.27±0.03）g/片表面光滑，色泽均匀，入口顺滑，清凉爽口，酸甜适宜，适合广大消费群体的功能性保健含片。

(3)葡萄籽提取物，辅以不同的配料，经混合、造粒、干燥、压片等工序，虽制成了低热量口含片，但还缺少含片的灭菌及包装，具体的保健效果及功效还有待考究，后期将对含片功能性成分的释放及对人体的保健效果进行深入探究。

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