1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖纯化研究

舒俊生 张尚明 陈开波 毛 健

SHU Jun-sheng1 ZHANG Shang-ming1 CHEN Kai-bo1 MAO Jian2

（1.安徽中烟工业有限公司技术中心，安徽 合肥 230088；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

（1.Research and Development Centre,China Tobacco Anhui Industrial Co.,LTD,Hefei,Anhui230088,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122,China)

在卷烟中应用的许多香料具有较强的挥发性，且在抽吸过程中释放不均匀。这些香料不但造成了卷烟生产的污染，还影响了卷烟产品质量的稳定性。为了克服这些缺陷，开发非挥发性香料前体势在必行。香料前体自身没有香味，只有在高温分解后才会生成大量香味成分。许多天然植物中糖苷、糖酯、Maillard反应的中间体都是重要的天然香味前体[1-3]。1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖（1-L-proline-1-deoxy-D-fructose，PDF）是葡萄糖和脯氨酸Maillard初级反应的中间体，是一种没有香味的白色固体，在烤烟中含量较高[4]。其在高温时热解可以生成大量呋喃类、吡喃类、吡嗪类等多种香味成分，是理想的卷烟香料前体物[5]。有关1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖合成方法的文献[6,7]较多，如保护法、固相合成法等，但关于其分离纯化的研究较少。因此，本试验采用沉淀法、纳滤法和树脂法对其进行分离纯化，并对这些方法纯化得到的PDF的纯度进行比较，以确定PDF最佳的纯化方法，为非挥发性香料前体的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

脯氨酸、葡萄糖：食品级，上海国药集团；

无水乙醇、异丙醇、无水甲醇、乙酸乙酯、丙酮：分析纯，上海国药集团；

1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖：纯度≥98%，凯氏（上海）科技有限公司；

旋转蒸发仪：R-215型，瑞士Buchi公司；

超滤纳滤仪：LNG-NF-101型，上海朗吉化工公司；

离子色谱仪：ICS3000型，美国Dionex公司；

超纯水器：Milli-Q型，美国密理博公司；

纳滤膜：M360型，截留分子量360 D，上海朗极化工科技有限公司；

阴离子交换树脂：201×7、SQD56和D301型，安徽皖东树脂有限公司；

阴离子交换树脂：Dowex50WX8型，陶氏化学公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖、脯氨酸及PDF离子色谱法分析 色谱条件：阴离子交换柱：CarboPac PA-1；柱温：30℃；淋洗液100 mM氢氧化钠溶液和50 mM醋酸钠溶液；流速：0.25 mL/min；进样量：10 μL；检测器：ED50；工作电极：金电极；参比电极：Ag/AgCl参比电极；分析时间：30min。

1.2.2 PDF的制备 称取葡萄糖0.3mol、脯氨酸0.6mol置于圆底烧瓶中，加入700mL无水甲醇，水浴72℃下回流7 h。

1.2.3 PDF的纯化 分别采用溶剂沉淀法、纳滤法、离子交换树脂层析法提纯PDF。

(1)溶剂沉淀法：将1.2.2制备的甲醇反应液浓缩至300mL，分别采用极性大小相近的有机溶剂丙酮、乙酸乙酯、异丙醇对目标物进行沉淀。

(2)纳滤法：将1.2.2得到的反应液中的溶剂减压蒸馏至干，加入1 L去离子水溶解。将此水溶液加入到纳滤装置的料液斗里，选用M360纳滤膜进行分离。

(3)离子交换树脂层析法：称取20 g Dowex50WX8（100～200目）树脂，使用0.5 mol/L HCl溶液活化0.5 h，湿法填柱，超纯水冲洗层析住，直至流出液pH至中性。取1.2.2反应液5 g减压挥干，10mL超纯水溶解，加入到层析柱进行分离，并收集含目标组分的滤液。

称取20 g D301树脂，使用0.5mol/L HCl活化4 h；用去离子水冲洗至中性后，用0.5mol/LNaOH溶液浸泡4 h，用去离子水冲洗至中性。201×7及SQD56阴离子交换树脂活化方法与D301树脂相同。3种树脂均采用湿法填柱。

1.2.4 PDF纯度分析 采用1.2.1的方法进行离子色谱分析，测定出葡萄糖、脯氨酸和PDF含量，计算出PDF纯度。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖、脯氨酸及PDF分析

糖类分子具有电化学活泼型及在强碱溶液中呈离子化状态，Rocklin等[8]报导了采用离子交换色谱柱分离，脉冲安培检测器测定糖的新方法。按照1.2.1色谱分离条件，对葡萄糖、脯氨酸和PDF进行了分离并绘制了标准曲线。由图1可知，葡萄糖、脯氨酸、PDF 3种物质得到良好的分离。葡萄糖、脯氨酸和PDF标准曲线的相关系数分别为0.999 9、0.999 9和1（图2），为后续研究奠定了基础。

2.2 PDF不同提纯方法比较

图1 葡萄糖、脯氨酸、PDF离子色谱图Figure 1 Ion chromatograph of glucose,proline and PDF

图2 葡萄糖、脯氨酸和PDF的标准曲线Figure 2 Standard curves of glucose,proline and PDF

2.2.1 溶剂沉淀法 不同的有机溶剂如丙酮、乙酸乙酯、异丙醇沉淀得到PDF的纯度不同（表1），比较后发现，采用丙酮沉淀下来的PDF混合物极容易潮解变黄，且纯度只有42%；采用乙酸乙酯沉淀得到的PDF纯度也只有35%，PDF混合物在乙酸乙酯中的溶解度较高，使得PDF不能得到很好的纯化；而采用异丙醇沉淀PDF比较理想，纯度可达62%，能有效克服上面两种沉淀溶剂的缺点。葡萄糖、脯氨酸和PDF在3种溶剂中都具有一定的溶解度，这可能是由于葡萄糖、脯氨酸和PDF都具有一定的极性，与不同溶剂间的作用力不同从而得到不同纯度的PDF。

表1 溶剂对PDF纯度的影响Table1 Effectof solvent on PDF purity /%

2.2.2 纳滤法 纳滤法的起始压力为2 000 kPa，流量为18.2 L/h。本试验研究了压力和流量对PDF纯度的影响。结果表明，流量为36.4 L/h，压力2 500 kPa，PDF纯度最高，可达92%（表2）。纳滤法比溶剂沉淀法具有更高的选择性，这可能是由于葡萄糖、脯氨酸和PDF 3种化合物的分子量（分别为180.16，115.13和277.29）差别较大，因此，纳滤法比溶剂沉淀法选择性较高。

2.2.3 离子交换树脂层析法 制备PDF的反应溶液中主要含有PDF、葡萄糖、脯氨酸，在水溶液状态下，皆为带负电荷阴离子极性化合物，可以采用阴离子交换树脂进行分离纯化。本试验研究了4种阴离子交换树脂对PDF纯度的影响。201×7和Dowex50WX8为强阴离子型，而D301和SQD56为弱阴离子型。阴离子交换树脂分离后，PDF的纯度见表3。由表3可知，两种强阴离子型交换树脂对PDF的纯化效果较好，纯度高达 93%（201×7）和 97%（Dowex50WX8）。而两种弱阴离子型树脂D301和SQD56的效果较差，PDF的纯度仅为78%（D301）和 80%(SQD56)。可能是因为脯氨酸 pKa=1.99，葡萄糖pKa=12.28，PDF是二者缩合物，其pKa值介于二者之间，3种化合物pKa相差较大，因此强阴离子交换树脂能够对这3种化合物具有较高分离度。

表2 纳滤流量和压力对PDF纯度的影响Table2 Effectof nanofiltration flow and pressure on PDF purity /%

表3 不同离子树脂对PDF纯度的影响Table3 Effect of different ion resin on PDF purity /%

综合比较以上3种分离纯化方法，离子交换树脂层析法优于其他两种方法，与要分离纯化物质的特性有关，脯氨酸、葡萄糖以及PDF的PKa相差较大，有利于使用强阴离子交换树脂进行离子交换。

3 结论

近年来，关于PDF化学制备的方法较多，但缺乏对其分离纯化的研究报道。因此，本试验对PDF纯化的方法进行了研究、比较，结果发现强阴离子交换树脂可以较好的分离纯化PDF，其纯度达90%以上。这是因为PDF是带负电荷的多羟基极性化合物，且离子交换树脂具有离子交换和吸附的双重作用，能对其进行有效的分离和纯化[9]。这为非挥发性香料前体的开发提供了科学的数据。

1 张正竹，宛晓春，陶冠军.茶鲜叶中糖苷类香气前体的液质联用分析[J].茶叶科学，2005，25(4)：275～281.

2 Lin Y,Wagner G J.Rapid and simplemethod for estimation of sugar esters[J].J.Agr.Food Chem.,1994,42(8):1 709～1 712.

3 Ames JM.Applications of themaillard reaction in the food industry[J].Food Chem.,1998,62(4):431～439.

4 杨金英，牟定荣，梅勇，等.HPLC-ELSD法测定烟草中的脯氨酸Amadori化合物[J].分析试验室，2010，29(8)：97～100.

5 张敦铁，殷发强，何佳文.三种Amadori化合物的热解研究[J].中国烟草学报，2006(2)：13～16.

6 Blank I,Devaud S,Matthey-Doret W,et al.Formation of odorants in Maillard model systems based on L-proline as affected by pH[J].J.Agr.Food Chem.,2003,51(12):3 643～3 650.

7 Frolob A,Singer D,Hoffmann R.Solid-phase synthesis of glucosederived Amadori peptides[J].J.Pept.Sci.,2007,13(12):862～867.

8 Rocklin D,Pohl C A.Determination of carbohydrate by anion exchange chromatography with pulse amperometric detection[J].Liquid Chrom,1983,6(9):1 577～1 590.

9 莫晓燕，詹谷宇，项昱红.二磷酸果糖的纯化研究[J].中国医药工业杂志，2001，32(3)：100～101.