荷叶中总黄酮和荷叶碱含量变化规律

赵昕岚 邓放明

ZHAO Xin-lan DENG Fang-ming

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

(1.Hunan Agricultural University Food Science and Technology College,Changsha,Hunan 410128,China;2.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha,Hunan 410128,China)

荷叶（lotus leaf）是睡莲科植物莲（nelumbo nucifera gaerth）的叶。在2002年3月中国卫生部卫监发（2002）第51号文件中，荷叶被列入“既是食品又是药品”的名单之中[1]。近年的研究[2,3]发现，荷叶除了含有碳水化合物、脂质、蛋白质、单宁等常规的化学成分外，还富含多种生物活性物质，其中黄酮类和生物碱类化合物的生物活性较高。荷叶的药理作用研究表明，荷叶主要具有调节血脂[4]、减肥、抗氧化[5]和抑菌等作用[6]。荷叶中的黄酮类化合物主要有槲皮素（quercetin）、异槲皮素（isoquercitrin）和莲苷等[7,8]；生物碱物质主要有荷叶碱、N-去甲荷叶碱、O-去甲荷叶碱、牛心果碱、亚美帕碱、原荷叶碱等[9]。目前，对荷叶的研究和利用，越来越受到人们的重视，其在食品和医药等领域具有广泛的前景。一些学者研究了不同采摘期荷叶中主要活性成分（黄酮或生物碱）含量的变化，但是荷叶在生长过程中每个月会不断地长出新生荷叶，单纯研究不同月份的荷叶不能够充分反应荷叶内部主要活性成分的变化规律。因此，本试验对同一批新生荷叶进行标记，分不同月份采摘，再采用分光光度法测定荷叶中总黄酮和荷叶碱两种物质的含量变化，为筛选荷叶及合理采收提供理论指导，同时为进一步有效控制荷叶质量提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

荷叶：5月中旬、6月中旬、7月中旬、8月中旬、9月中旬、10月中旬和11月中旬采摘于湖南宏兴隆食品有限公司湘莲基地；

芦丁标准品：南京泽朗医药科技有限公司；

荷叶碱标准品：中国药品生物制品检定所；

无水乙醇、甲醇、NaOH固体：分析纯，中国国药集团上海化学试剂厂；

三氯甲烷、盐酸：分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司；

蒸馏水：本实验室制备。

1.1.2 主要仪器设备

高速中药粉碎机：ZN-400A型，长沙市岳麓区中南制药机械厂；

电热鼓风干燥箱：101-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子分析天平：AUY220型，日本Shimadzu公司；

紫外分光光度计：UV-2450型，日本Shimadzu公司；

恒温水浴锅：DZKW-S-4型，北京市永光明医疗仪器厂；

pH计：PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB-ⅢT型，郑州长城科工贸易有限公司；

旋转蒸发器：RE52-3型，上海沪西分析仪器有限公司；

数控超声波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的收集 5月中旬时，在湘潭宏兴隆食品有限公司的湘莲基地，选择刚立出水面，叶片尚未撑开的新生荷叶进行标记，将标记好的荷叶作为本试验的原材料。分别在5月中旬、6月中旬、7月中旬、8月中旬、9月中旬、10月中旬和11月中旬，采集被标记过的荷叶。根据荷叶的生长天数及外观特征，将荷叶的生长期分为以下几个阶段：立叶期、营养生长期、成熟期和衰亡期。不同生长期荷叶的外观特征见表1。

表1 不同生长期荷叶的外形特征Table1 Shape characteristics of lotus leaf in the different growing periods

1.2.2 原料的预处理与提取 将新鲜的荷叶清洗干净，放置在70℃的恒温干燥箱中干燥4 h。将烘干后的荷叶用高速粉碎机粉碎，过40目筛。备用。

称取0.5 g荷叶粉末，按照料液比1∶35(m∶V)，加入60%乙醇溶液，50℃下超声提取30min，抽滤后，经旋转蒸发仪浓缩至无醇味，定容至50mL，即得到荷叶总黄酮提取液。称取5 g荷叶粉末，按照1∶30(m∶V)的料液比，加入80%的乙醇溶液，在90℃下冷凝回流提取3 h。提取结束后，旋转蒸发，将粗提液中的乙醇挥发，用0.5%HCl溶液调节pH值至2～3，抽滤，用40 mL氯仿分2次萃取，弃氯仿层，除去脂质。在剩余的水层中加入0.5%NaOH溶液调节pH值至7左右。静置数分钟后，过滤，再加入0.5%NaOH溶液调节pH值至12以上。用100mL氯仿分3次萃取[10]，合并氯仿液，在旋转蒸发器上蒸干氯仿，加入一定量的甲醇，在超声波清洗器中洗脱30min，定容至50mL，即得到荷叶碱提取液。

1.2.3 不同生长期荷叶中总黄酮含量的比较

(1)芦丁标准品的制备：精确称取芦丁标准品20mg，溶于95%的乙醇溶液中，转移至100mL容量瓶中，定容，摇匀，即得到0.2mg/mL的芦丁标准品溶液。

(2)芦丁标准曲线的绘制：采用NaNO2—Al(NO3)3—NaOH显色方法测定黄酮含量[11]。精密吸取浓度为0.2mg/mL的芦丁标准品溶液 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 分别于 25 mL的容量瓶中，用95%的乙醇溶液稀释到10 mL，加入0.7 mL质量分数5%的NaNO2溶液，充分摇匀，静置5 min，再加入0.7 mL质量分数10%Al(NO3)3溶液，充分摇匀，静置5 min，再加入5mL 1mol/L的NaOH溶液，用95%的乙醇溶液定容至25mL，混匀放置10 min后，在510 nm处测定其吸光度。以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，所对应的吸光度值为纵坐标，绘制芦丁的标准曲线。

(3)总黄酮含量的测定方法：精密吸取1 mL荷叶总黄酮提取液置于25 mL容量瓶中，按照上述方法显色，在510 nm处测定其吸光度，并按式(1)计算总黄酮含量。

式中：

R——总黄酮含量，mg/g；

c——样品吸光度对应的芦丁浓度，μg/mL；

w——荷叶质量，g。

1.2.4 不同生长期荷叶中荷叶碱含量的比较

(1)荷叶碱的标准品的制备：精确称取荷叶碱标准品20mg，溶于甲醇溶液中，转移至50mL容量瓶中，定容，摇匀，即得到0.4mg/mL的荷叶碱标准品溶液[12]。

(2)荷叶碱标准曲线的绘制：精密吸取0.4mg/mL的荷叶碱标准品溶液 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mL，分别置于25mL容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，充分摇匀，以甲醇溶液为空白，在270 nm处测定吸光度[13]，以荷叶碱标准溶液的浓度为横坐标，所对应的吸光度值为纵坐标，绘制荷叶碱标准曲线。

(3)荷叶碱含量的测定方法：精密吸取0.1mL荷叶碱提取液置于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度。以甲醇溶液为空白，在270 nm处测定吸光度，并按式(2)计算荷叶碱含量。

式中：

R——荷叶碱含量，mg/g；

c——样品吸光度对应的荷叶碱浓度，μg/mL；

w——荷叶质量，g。

2 结果与分析

2.1 不同生长期荷叶中总黄酮的含量变化规律

2.1.1 芦丁标准曲线的建立 在510 nm处测定系列芦丁标准溶液的吸光度，结果见图1。由图1可知，芦丁标准品溶液的线性回归方程为Y=0.010 7X+0.001 8，R2=0.999 8。芦丁在浓度为0～48μg/mL内线性良好。

图1 芦丁的标准曲线Figure 1 Standard curve of rutin

2.1.2 不同生长期荷叶中的总黄酮含量 不同生长期荷叶中总黄酮的含量见图2。

图2 不同生长期荷叶中黄酮含量变化规律图Figure 2 Variation diagram of flavonoid contentof lotus leaf in the differentgrowing periods

由图2可知，不同生长期荷叶中的总黄酮含量变化范围在30.98～84.21mg/g。从立叶期到成熟期，荷叶中的总黄酮含量随着荷叶的生长不断增加；在8月中旬时，总黄酮含量达到最高值84.21mg/g；之后随着荷叶的衰老，总黄酮的含量也迅速下降。这样的变化规律可能是因为在荷叶的营养生长期中，荷叶不断地从外界获取营养物质，同时体内的黄酮类物质也不断地积累；当荷叶完全成熟时，体内黄酮物质的含量也达到最高值；当荷叶进入衰亡期时，荷叶干枯，体内水分大量流失，可能也带走了一些活性物质，导致黄酮类物质也不断地损失。

由表2可知，不同生长期荷叶中黄酮含量是有极显著差异的。由表3多重比较结果可知，在α=0.05水平下，8月中旬的荷叶中黄酮含量显著高于其他月份的；且每个月份的荷叶中黄酮含量都存在显著差异。在α=0.01水平下，8月中旬的荷叶中黄酮含量极显著高于其他月份的；10月中旬的荷叶和6月中旬的荷叶中黄酮含量差异不显著，其他月份的荷叶中黄酮含量差异均极显著。

表2 不同生长期荷叶中黄酮含量的方差分析表Table2 Analysis of variance table of flavonoid content of lotus leaf in the differentgrowing periods

表3 不同生长期荷叶中黄酮含量的多重比较表（SSR法）Table3 Multiple comparisons table of the rate of flavonoid content of lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

表3 不同生长期荷叶中黄酮含量的多重比较表（SSR法）Table3 Multiple comparisons table of the rate of flavonoid content of lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

相同字母表示两者间差异不显著，不同字母表示两者间差异显著。

类型 平均数/(mg·g-1) 差异显著性α=0.05 α=0.01 8月中旬9月中旬7月中旬10月中旬6月中旬11月中旬5月中旬84.21 65.68 60.83 54.24 52.72 42.33 30.98 a b c d e f g ABCDDEF

2.2 不同生长期荷叶中荷叶碱的含量变化规律

2.2.1 荷叶碱标准曲线的建立 在270 nm处测定系列荷叶碱标准溶液的吸光度，结果见图3。由图3可知，荷叶碱标准品溶液的线性回归方程为Y=0.072 7X-0.013 8，线性相关系数为R2=0.997 3。结果表明，荷叶碱在浓度为0～11.2μg/mL内线性良好。

图3 荷叶碱标准曲线图Figure 3 Standard curve of nuciferine

2.2.2 不同生长期荷叶中的荷叶碱含量 不同生长期荷叶中荷叶碱的含量见图4。

图4 不同生长期的荷叶中荷叶碱含量变化规律图Figure 4 The variation diagram of nuciferine content of lotus leaf in the different growing periods

由图4可知，不同月份的荷叶中荷叶碱含量变化范围在1.084～2.132mg/g。从立叶期到成熟期，荷叶中的荷叶碱含量随着荷叶的生长不断增加；7、8月时，荷叶中荷叶碱含量迅速升高，在8月时，达到了最高含量2.132mg/g；可能是因为，荷叶在7、8月处于营养生长期，荷叶内迅速积累生物碱类物质；当荷叶成熟后，进入衰亡期，荷叶碱的含量逐渐下降。

由表4可知，不同生长期荷叶中荷叶碱含量是有极显著差异的。由表5多重比较结果可知，8月中旬、9月中旬、10月中旬和11月中旬的荷叶之间荷叶碱含量没有显著差异，但是荷叶碱含量极显著高于6月中旬和5月中旬的荷叶中荷叶碱含量。6月中旬和5月中旬的荷叶之间荷叶碱含量也没有显著差异。

表4 不同生长期荷叶中荷叶碱含量的方差分析表Table4 Analysis of variance table of nuciferine content of lotus leaf in the different growing periods

表5 不同生长期荷叶中荷叶碱含量的多重比较表（SSR法）Table5 Multiple comparisons table of the rate of nuciferine contentof lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

表5 不同生长期荷叶中荷叶碱含量的多重比较表（SSR法）Table5 Multiple comparisons table of the rate of nuciferine contentof lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

相同字母表示两者间差异不显著，不同字母表示两者间差异显著。

类型 平均数/(mg·g-1) 差异显著性α=0.05 α=0.01 8月中旬9月中旬10月中旬11月中旬7月中旬6月中旬5月中旬2.132 2.119 1.934 1.866 1.838 1.194 1.084 aaaaabb AAAAABB

3 结论

荷叶在不同生长期总黄酮和荷叶碱含量存在差异。荷叶从生长到干枯的过程中，内部黄酮的含量是随着生长不断上升，在8月份达到最大值84.21 mg/g；荷叶进入衰亡期后，内部黄酮含量又迅速下降。荷叶碱的含量也是先上升后下降的趋势。营养生长期时，荷叶内部的荷叶碱含量迅速增加，荷叶成熟时荷叶碱含量达到了最大值2.132mg/g；进入衰亡期后，荷叶碱物质也慢慢流失。

康璇等[14]以安徽的干荷叶为材料，用乙醇热提法提取荷叶总黄酮，最高含量为22.3 mg/g，比本试验8月份荷叶总黄酮含量低很多，说明超声辅助提取法比热提法效果好；荷叶总黄酮的含量可能与荷叶的产地也有关，这有待今后进一步研究。另外荷叶的质量与水质、土壤、气候等环境因素及内在的遗传机制也有关；荷叶中的有效成分的形成和积累与其生态环境也息息相关[15]。本试验发现，荷叶中总黄酮和荷叶碱的含量均在成熟期时达到最大值，两者变化规律的机理和两者变化之间的联系还需进一步研究。

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7 李彩侠.荷叶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].上海理工大学学报，2006,28（1）:5～8.

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14 康璇，王在贵,高雪英,等.荷叶黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2009，37(23):1 179～1 180.

15 陶曙红，吴凤锷.生态环境对药用植物有效成分的影响[J].天然产物研究与开发，2003,15（2）：174～177.