油污土壤植物与真菌联合生物修复的研究

于会佳　杨丽娜　孟天天　黄依玲

摘 要：利用具有石油烃降解能力的真菌與植物复配，探讨不同植物与真菌联合修复油污土壤的效果。将4种植物（玉米、玉米草、黑麦草、紫花苜蓿）与2种真菌（Fungal sp.、Stachybotrys sp.）在5种浓度油污土壤（0.1%，0.5%，1%，1.5%，2.0%）中进行单接种及双接种种植试验，以7 d为单位测定石油烃降解率，筛选出对各浓度油污土壤修复效果最佳的复配方案。结果表明，玉米、玉米草和黑麦草单接种处理原油降解效果较好，且在油污浓度为1%时，3种植物均达到最高的降解效率。当油污浓度高于1.5%时，紫花苜蓿混合接种处理对油污的降解率明显升高，最大可达到87%。紫花苜蓿在混合接种条件下更适合高浓度油污土壤的生物修复，推广价值更大。

关键词：油污土壤；植物-真菌联合修复；单接种；混合接种

中图分类号：X172 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.018

在原油的开采、运输、使用以及石油产品的加工和生产过程中，不可避免的泄露对环境造成了严重的危害，尤其是对土壤。原油的成分复杂，包括直链烷烃、支链烷烃、多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）等多种化学成分，其中16种多环芳烃已被世界环境卫生组织列为具有高度危害的环境污染物之一。多环芳烃在生成、迁移、转化和降解的过程中，通过呼吸道、皮肤、消化道进入人体，极大地威胁着人类的健康，有很强的致畸、致癌、致突变作用[1-4]。研究发现，细菌、真菌、藻类都具有降解多环芳烃的能力，随着PAHs苯环数量的增加，其降解速率也越来越低，所以低分子量的PAHs在环境中能较快地降解，存在的时间短；而高分子量的PAHs难于降解[5]。

植物-微生物联合治理环境污染是近年来人们研究的热点，其高效、简便、无二次污染的优点是其被广为采纳的重要原因。胡长庆等[6-7]从油污土壤及海水中分离出了3种丝状石油降解真菌，在实验室的模拟污染土壤修复试验中均表现出了良好的石油降解能力，并探索了复合菌群最佳原油降解条件。笔者利用已筛选出的能够有效降解石油烃的2种真菌以及适应北方寒冷气候的植物，研究真菌与植物联合对土壤中石油污染的修复效果，并寻找二者的最佳组合及实施方案，在修复土壤中污染物的同时，恢复污染土壤的植被，达到污染土壤生态修复、改善土壤微环境的目的。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 植物与真菌 选取适宜北方寒冷地区生长的4种禾本科与豆科植物，分别为玉米、玉米草、黑麦草和紫花苜蓿。种子由大庆市种子公司提供。供试真菌为已鉴定具有较好石油烃降解能力的真菌（Fungal sp.）和葡萄穗酶菌（Stachybotrys sp.），以下用H3和H4代替，菌种经活化，在CPDA平板上扩大培养后作为供试菌剂。

1.1.2 油污土壤 采集大庆地区星火牧场5～10 cm土层土壤，阴凉处风干，过4 mm筛，去除草根、枯草等。将取自大庆油田的原油在90 ℃蒸发3 h，去除易挥发的短链烃后[8]，用适量石油醚溶解配制成10%的原油原液，与风干的土壤混匀，配制成浓度分别为0.1%，0.5%，1%，1.5%，2%的油污土壤，分装到直径10 cm的营养钵中，待用。

1.2 方 法

1.2.1 种子的处理 4种植物的种子在0.05%的高锰酸钾溶液中浸泡1 h，洗掉高锰酸钾溶液后用蒸馏水冲洗3遍，洗净种子表面的高锰酸钾溶液。将种子放在湿润的脱脂棉上，放入恒温培养箱中25 ℃诱导发芽48 h后播种。每个营养钵中播种15粒，表面覆土约1 cm。

1.2.2 制备菌块 将无污染的H3、H4固体菌种连同培养基切成1 cm×1 cm的小正方形，接种到新配制的CPDA固体培养基上，26 ℃倒置培养。待长满平板后，选择灭菌直径为1 cm的打孔器进行打孔，从打孔器中取出菌块接种于油污土壤中。

1.2.3 不同接种方式的原油降解试验 选取油污浓度为1%的土壤，对4种植物分别进行不同接种方式的原油降解试验，即玉米、玉米草、黑麦草和紫花苜蓿四种植物与H3单接种，与H4单接种，与H3、H4混合接种进行原油降解实验。在种子长出子叶后的第7，14，21，28，35天分别测定原油降解率，探讨接种方式对植物-真菌联合修复的影响。

1.2.4 不同油污浓度的原油降解试验 4种植物均采用混合接种方式即H3和H4联合接种，接种于5种油污浓度的土壤中进行原油降解试验，在种子长出子叶后的第7，14，21，28，35天分别测定原油降解率，探讨植物-真菌在不同油污浓度下的降解效果。

1.2.5 原油降解率测定 对每个处理分别在第7，14，21，28，35天时，取土样约5 g，用脱脂滤纸包好，烘干样品至恒质量，称质量。采用有机溶剂超声波萃取法提取总烃，步骤如下：土样放入50 mL离心管中，加入石油醚10 mL，震荡混匀，超声波萃取10 min，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清，重复1次；加入二氯甲烷10 mL，超声波萃取10 min，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清；加入三氯甲烷10 mL，超声波萃取10 min，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清，取出萃取后的土样，烘干至恒质量，用重量法测定原油的含量[9]，计算原油降解率，公式如下：

原油降解率=×100%

式中，m0为最初原油质量（mg）；m1为样品处理后的原油质量（mg）；m2为空白样品中损失的原油质量（mg）。

2 结果与分析

2.1 不同接种条件下植物与真菌联合降解的效果

选取1%油污浓度的土壤对4种植物与H3、H4分别进行单接种和混合接种试验，在第7，14，21，28，35天根据公式测定原油降解率。玉米、玉米草和黑麦草这3种植物在油污浓度为1%，单接种条件下的原油降解率均大于混合接种（图1～3），玉米草和黑麦草与H3单接种的最终原油降解率稍高，而玉米与H4单接种处理对油污的降解率最大（86%），说明H4（葡萄穗酶菌Stachybotrys sp.）与玉米根系形成了良好的互惠共生体系，其根在土壤中生长、伸长会疏松土壤，为单一菌种的真菌利用石油创造有利条件，同时真菌的代谢产物能提高土壤中碱性磷酸酶的活性，促进玉米对磷的吸收而增进玉米生物量[10]。而紫花苜蓿与H3和H4混合接种的降解效果明显高于单接种处理，且达到了几种处理中最高的降解率（88.7%）（图4）。紫花苜蓿属豆科植物，由于其根系发达而对逆境耐受能力较强，豆科植物根际分泌物中含有碱性磷酸酶成分，而磷素是根瘤固氮必需的[11-12]，真菌侵入根瘤内部[13]，对提高吸收磷素十分有利。真菌、紫花苜蓿与根瘤菌互惠共生，在土壤微环境中相得益彰[14]。

2.2 油污浓度对植物与真菌联合降解原油的影响

如图5所示，在土壤油污浓度为0.5%～1.5%之间时，玉米的混合接种联合处理比另外3种植物具有较高的降解率，而在油污浓度较高的2%土壤中，紫花苜蓿表现出了良好的降解效果，而最终降解率可达87%。从整体趋势看，玉米、玉米草和黑麦草都在油污浓度为1%时表现出了最高的原油降解率，而紫花苜蓿的原油降解率随油污浓度的升高而升高，玉米、玉米草和黑麦草属禾本科植物，与原油降解真菌联合接种较适合于对油污浓度在1.5%以下的土壤进行生物修复，而紫花苜蓿与原油降解真菌则对油污浓度为2%甚至以上的土壤生物修复中将会有良好的表现。

3 结论与讨论

通过对玉米、玉米草、黑麦草和紫花苜蓿与2种原油降解真菌联合接种试验发现，紫花苜蓿与2种真菌联合接种的处理具有较好的降解效果，而且随着油污浓度的增加，降解效率越高，紫花苜蓿与真菌的联合接种体系在油污土壤的生物修复过程中是值得应用的，并且紫花苜蓿作为一种北方常用的牧草，其根部在土壤中修复环境污染的同时，地上部分也可方便地收割处理。能够与真菌联合修复油污土壤的草本、禾本科植物甚至农作物还有很多，可以预计，随着研究范围的不断扩大及方法的逐渐成熟，它在环境保护、修复污染土壤方面一定会有更广阔的应用前景。

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