基于亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的细胞与活体成像

2013-04-29 00:31:22周冰王玉双杨淑娜何晓晓王柯敏
湖南大学学报·自然科学版 2013年5期

周冰 王玉双 杨淑娜 何晓晓 王柯敏

摘要:采用反相微乳液法,制备了以亚甲基蓝为内核材料的亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒,通过优化亚甲基蓝的包裹浓度获得荧光信号较强的纳米颗粒,并初步考察了其用于Hela细胞标记与体内示踪的可行性.通过MTT实验考察了颗粒对细胞的毒性影响以及较为适宜的标记细胞的浓度,结果表明:当颗粒浓度为1 mg/mL时,细胞的存活率仍有80%左右.利用激光共聚焦显微镜考察了Hela细胞对颗粒的吞噬情况以及颗粒在细胞内的分布情况,结果表明,该颗粒能被Hela细胞吞噬且主要分布在溶酶体内.活体荧光成像结果显示,尾静脉注射该颗粒后,裸鼠全身都发射出近红外荧光信号,随着血液的循环,颗粒慢慢聚集在肝脏等器官中.以上结果表明,包裹亚甲基蓝的二氧化硅纳米颗粒可以用于细胞的标记和体内示踪成像.

关键词:活体荧光成像;二氧化硅纳米颗粒;亚甲基蓝;纳米颗粒

中图分类号:O614124文献标识码:A

在各种组织和器官都保持完整的状态下有效地观察肿瘤细胞进入体内的分布、迁徙等生物学行为离不开细胞标记和体内示踪技术,这对于临床医学上肿瘤的判断、治疗和手术等有着重要的意义.在各种细胞标记及活体示踪技术中,荧光成像技术因其非侵入性及可重复性的特点而成为越来越多的研究者选择的细胞标记及体内示踪的方法[1].传统的细胞体内成像主要依靠一些有机荧光染料,如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、吲哚类菁染料等,它们由于具有较差的光稳定性及半衰期短等缺点,从而在进行高灵敏检测及较长时间的细胞体内成像研究中受到限制.发展合适的标记成像探针已成为当前细胞标记与体内成像研究的热点之一.

随着纳米技术的发展,基于功能化荧光纳米材料的标记技术为细胞和活体标记示踪研究提供了新的思路.目前标记、示踪细胞和活体研究最多的纳米材料主要有量子点[2]、荧光纳米颗粒[3]等.相对于传统荧光染料而言,量子点具有较好的量子产率、大的Stokes位移、好的抗光漂白能力与组织穿透力[4].但是,使用量子点进行活体成像的最大挑战在于量子点长期毒性的不确定性[5].二氧化硅荧光纳米颗粒因合成过程更为简便,对细胞的毒性要弱,生物相容性更好,可作为药物载体达到细胞治疗的目的等优势成为一种理想的成像探针并已经在生物医学成像研究中得到广泛应用[6].如本研究小组在二氧化硅荧光纳米颗粒的制备和应用研究方面开展了系统的工作.利用油包水反向微乳液方法成功制备出多种包裹不同荧光染料(如RuBpy,Cy5.5和FITC等)的二氧化硅荧光纳米颗粒,这些纳米颗粒在分子和细胞层面的成像和检测中得到了很好的应用[7-10].然而,针对活体这个特殊的研究对象,由于动物体在可见光的激发下自身组织会有较强背景荧光,严重干扰目标探针信号的准确度和灵敏度,而在近红外光区,生物组织对光的吸收较少,光的组织穿透力强,成像信背比相对较高[11-12],从而使得近红外二氧化硅荧光纳米颗粒成为细胞标记与活体成像的理想材料之一.

目前所报道的包裹近红外荧光染料种类较少而成本相对较高,亚甲基蓝是一种廉价的近红外染料,并且已用于生物样品的荧光分析中[13].本文采用反相微乳液法,制备以亚甲基蓝为内核材料的亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒,通过优化亚甲基蓝的包裹浓度获得荧光信号较强的纳米颗粒.通过MTT实验来考察颗粒对细胞的毒性效果以及较为适宜的标记细胞的浓度.利用激光共聚焦显微镜来考察Hela细胞对颗粒的吞噬情况以及颗粒在细胞内的分布情况,在此基础上,进一步通过活体荧光成像系统考察颗粒体内示踪成像的可行性.

1.2.7亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒用于活体成像

在颗粒进行Hela细胞示踪成像之前,首先对颗粒的活体荧光成像情况进行考察.具体步骤为:取两组裸鼠,每只裸鼠在实验时,肌肉注射50 μL的异丙嗪,30 min后再按照80 mL/20 g剂量进行腹腔注射浓度为2%戊巴比妥钠,等到完全麻醉后从尾静脉注射12.5 mg/mL的亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒 200 μL,取不同的时间点对小鼠进行活体成像,观察体内荧光分布变化情况.活体成像系统采用635 nm的红光激发,680 nm~800 nm收集,曝光时间1 000 ms.(所有动物实验操作均遵守湖南省实验动物中心实验动物使用和保护规章制度,许可证:NO.SYXK(湘)2008-0001).共重复3次.取第2组裸鼠作为对照,不注射亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒,重复3次.实验中所使用的裸鼠均为4~6周龄,体重在15~20 g之间,裸鼠用屏蔽的动物隔离器饲养,温度控制在28 ℃左右,湿度在40%左右,饲养条件完全按照裸鼠饲养条件进行饲养.

为了对活体荧光成像结果的准确性进行证实,在尾静脉注射亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒90 min后对裸鼠进行解剖,取出其部分器官进行荧光成像.将未注射的裸鼠同时解剖作为对照,同样对解剖后的裸鼠和取出的相应器官进行荧光成像.器官的摆放按照从上到下、从左至右的顺序依次为:无食物残渣的小肠、膀胱、肾脏、脾脏、心脏、肺、皮肤、肝脏、肌肉、含食物残渣的大肠.

为了进一步验证活体荧光成像结果,对裸鼠、亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒、裸鼠饲料同时进行活体荧光成像考察.活体成像系统采用615~665 nm的红光激发,680~800 nm收集,曝光时间200 ms.

2结果与讨论

2.1亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的制备及亚甲

基蓝浓度的优化

通过反相微乳液法制备了亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒.为了考察亚甲基蓝是否包裹进二氧化硅纳米颗粒内,采用紫外可见分光光度计来考察纯亚甲基蓝染料和亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒在水相中的吸收光谱,采用活体成像仪测定亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的荧光发射光谱.结果如图1所示,纯亚甲基蓝染料的紫外最大吸收峰约为650 nm,制备成亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的最大吸收峰蓝移至620 nm左右,没有很大改变.通过对颗粒的荧光发射光谱测定可以看出,亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的最大发射峰大约在710 nm这些吸收峰和发射峰都在近红外区域,说明已成功制备了亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒.这为能更灵敏的进行细胞标记和

活体示踪成像奠定了一定的基础.从颗粒的荧光成像图可以看出亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒具有较强的荧光强度.此结果表明亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒能够为体内示踪成像提供较好的荧光信号.

基于以上的实验结果,可以得出本文制备的亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒可以用于细胞标记及体内示踪成像,但要想进行高灵敏的荧光成像,必须要解决裸鼠食物荧光信号对目标信号的干扰.因此在设计近红外荧光探针来进行细胞标记及活体成像研究中,不仅要考虑降低可见光区裸鼠的组织自发荧光还要考虑降低近红外光区裸鼠食物的荧光信号.

3 结论

本文通过优化亚甲基蓝的包裹浓度获得了荧光信号较强的亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒,并初步考察了该颗粒的Hela细胞标记成像和活体荧光成像.结果表明,包裹亚甲基蓝的二氧化硅纳米颗粒可以用于细胞标记和体内示踪成像.但是由于在相同的成像条件下,裸鼠食物的荧光信号也很强,干扰了成像的灵敏度.因此,发展一种能同时克服裸鼠组织自发荧光与裸鼠食物荧光信号的成像探针对于进行高灵敏的细胞标记及体内示踪成像具有重要的意义,这有待于进一步的研究.

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