断藤益母汤含药血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及TNF—α分泌的影响

梁江 林昌松 林云斌

【摘 要】目的：探讨断藤益母汤含药血清对体外培养的类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞增殖以及肿瘤坏死因子-α的影响和机制。方法：体外培养类风湿关节炎滑膜成纤维细胞，取第3～5代细胞，分别加入按临床常规口服剂量折算制取的来氟米特和断藤益母汤家兔含药血清，对照组加入正常家兔血清，MTT法检测24 h、48 h、72 h后各组含药血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响。ELISA法检测72 h后各组细胞培养上清肿瘤坏死因子-α的含量。结果：相对于对照组，来氟米特和断藤益母汤含药血清作用48 h、72 h，二者均能显著抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖（Ρ < 0.05），72 h后来氟米特组抑制率明显高于断藤益母汤（Ρ < 0.05）；相对于对照组，两种含药血清对肿瘤坏死因子-α也有显著抑制作用（Ρ < 0.05），组间差异不明显（Ρ > 0.05）；结论：成人临床常规剂量的断藤益母汤含药血清作用48 h、72 h后能显著抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖，并可降低该细胞肿瘤坏死因子-α分泌量，这可能是该方药改善类风湿关节炎患者临床症状的潜在机制之一。

【关键词】 关节炎，类风湿；断藤益母汤；含药血清；滑膜成纤维细胞；肿瘤坏死因子-α；实验研究；动物

Effects of Serum Containing Duanteng Yimu Decoction on Proliferation of Fibroblast-like Synoviocytes and TNF-α Production in Patients with Rheumatoid Arthritis

Liang Jiang，Lin Chang-song，Lin Yun-bin

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of serum containing duanteng yimu decoction （DYD） on proliferation of fibroblast-like synoviocytes （FLS） and TNF-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） production in rheumatoid arthritis patients.Methods：3 kinds of rabbits serum [normal，serum containing leflunomide （LEF），serum containing DYD] were made.RA-FLS were separated from knee joints of RA patients and subcultured for 3-5 generations.RA-FLS cells were divided into 3 groups： the control group，the LEF group （serum containing LEF） and the DYD group （serum containing DYD） and then proliferation of cells in 3 groups were evaluated by MTT at three time points （24，48，72 h）.After 72 h，cell culture medium was used to detect the TNF-α level with ELISA method.Results：Compared with the control group，after 48 h，72 h，Leflunomide and DYD serums have obviously inhibitive effects on the prolifration of RA-FLS from patients （Ρ < 0.05）.After 72 h，prolifration of RA-FLS in the LEF group was lower than the DYD group （Ρ < 0.05）.Compared with the control group，the two medicated serums have obvious inhibition on the TNF-α level （Ρ < 0.05），but with no significant difference between medicated serum groups （Ρ > 0.05）.

Conclusion：DYD can inhibit RA-FLS proliferation in conventional dose and reduce the production of TNF-α，which suggests one of the therapeutic mechanisms of DYD for RA.

【Key words】 arthritis，rheumatoid；duanteng yimu decoction；medicated serum；fibroblast-like synoviocytes；tumor necrosis factor-α；experimental study；animal

在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）病情进程中，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）过度增殖，同时释放大量诸如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子和炎症介质，导致了滑膜炎和骨侵蚀的持续，因此，抑制RA-FLS增殖、降低外周血和关节液中TNF-α的含量已成为治疗RA的可行方法[1]。断藤益母汤由林昌松教授根据RA急性活動期“肝肾亏虚，风湿瘀阻”中医病机研制出的经验方，本实验（2011年7月至2012年3月）拟观察该方含药血清对体外培养人RA-FLS增殖及其TNF-α分泌的影响。

1 实验材料

1.1 滑膜组织来源 选取2011年在广州中医药大学第一附属医院行膝关节置换术的女性RA患者2例，均符合1987年美国风湿病学会修订的类风湿关节炎诊断标准，标本获取经由患者及主管医师知情同意。

1.2 药品与试剂 断藤益母汤（DYD）由川续断15 g、桂林产昆明山海棠45 g、益母草15 g组成。所有中药饮片均购自广州致信药业有限公司，水煎2 次合并药液，3次过滤浓缩，给药时以注射用水定容至0.6 g·mL-1；来氟米特（LEF），国药准字H31020644，批号201103，规格20 mg，购自江苏欣凯-长征有限公司。I型胶原酶、RPM I1640培养液、胰蛋白酶、胎牛血清，购自美国Invitrogen公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）， 购自美国Sigma公司。

1.3 主要仪器 高速低温离心机（LAB-Y01型，TCHLAB，广州）；酶联免疫检测仪（美国BIO—RAD680公司）；倒置显微镜（OLYMPUS-Ⅱ，日本）；CO2培养箱（HF90型，郑州南北仪器有限公司生产）。

1.4 实验动物 雄性新西兰大耳兔12只，5周龄，体质量（2.0±0.5）kg。动物许可证号：SCXK（粤）2008-0020。由广东省动物实验中心提供并饲养在清洁级环境中。

2 方 法

2.1 给药干预与含药血清的制备 按随机数字法将受试家兔平均分为3组，并按以下方法连续灌胃7 d。DYD组：3.45 g·kg-1DYD；LEF组：1.92 mg·kg-1

LEF。（家兔给药量均按50 kg成人常用剂量折算，其中LEF为20 mg ，每日1次，中药按生药量90 g，每日1次）。对照组给予15 mL生理盐水，分早晚2次连续灌胃1周。按文献[2]所述方法制取含药血清：所有家兔在末次给药1 h后心脏采血，离心取血清，56 ℃ 水浴灭活30 min，0.2 μm微孔滤器过滤，-20 ℃冻存备用。

2.2 RA-FLS的原代培养与鉴定 按文献[3]提供的组织块法用RA滑膜组织进行RA-FLS原代培养：将手术取得的滑膜组织剪去脂肪组织和较大的血管，用生理盐水漂洗3次，去除血污杂质，剪成1 mm3碎屑后，用移液管吸附移入培养瓶，然后用2 mL注射器针头将组织块在瓶底按大约5 mm间距排布，反转培养瓶，在未铺排组织块的一侧瓶底注入培养液，培养瓶置入37 ℃、CO2体积浓度为5%的培养箱内4 h，再次反转培养瓶使贴壁的组织块接触培养液，视细胞生长情况2～5 d更换1次培养液。当细胞长至融合度约70%时予传代处理：培养液中加入0.25%的胰蛋白酶1 mL消化至细胞皱缩变圆时，加入培养液终止消化，将细胞悬液再次按1∶2分瓶培养，取第3～5代细胞，细胞爬片经苏木精-伊红染色（HE）倒差显微镜鉴定纯度在95%以上计为合格，用于后续试验。

2.3 各组细胞抑制率与培养上清TNF-α含量的检测 取3～5代细胞，按每孔100 uL单细胞悬液（内含约2 000个细胞）植入96孔培养板，待细胞铺满培养板80%左右时，每孔更换为90 μL的RPM I1640 培养液，分3组干预。对照组加入10 μL正常家兔血清；LEF组加入10 μL LEF家兔血清；DYD组加入10 μL DYD家兔血清。在37 ℃、体积浓度5 % CO2培养箱中分3个时点培养（24 h、

48 h、72 h），72 h后留取各组细胞培养上清按ELISA试剂盒说明检测TNF-α含量，每组6个复孔。分别于24 h、48 h、72 h后取各组细胞，加入浓度为5 mg·mL-1的噻唑蓝10μL共培养4 h，弃上清液，加DMSO 200μL作用10 min，在设定波长为490 nm

条件下用酶联免疫检测仪检测各组细胞吸光度值（OD值），按公式计算药物对细胞增殖的抑制率，公式如下：抑制率%=（1-含药血清组OD值/对照组OD值）×100%。

2.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析，所有数据以表示，采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 RA-FLS的培养鉴定 在倒差显微镜下观察细胞形态所见如下：原代RA-FLS成长呈长纤维状，以原组织块所在位置（因细胞贴壁成功，原组织块已经移去）为中心呈射线状向周围辐射生长，间杂少量圆形的巨噬样滑膜细胞；培养5～10 d

后，原代RA-FLS增殖与传代速度明显增快，巨噬样滑膜细胞因在此培养环境内增殖慢，凋亡快，数目不断减少，见图1。第3代RA-FLS的HE染色细胞爬片显示：第3代的RA-FLS细胞呈典型的长纤维状或纺锤形，卵圆形细胞核位于细胞质中间，核仁明显较原代增大，视野内细胞密集程度增高，巨噬样细胞进一步减少，而RA-FLS所占比例大于95%，与文献报道的特征相符，见图2。

3.2 各组血清干预对RA-FLS增殖抑制情况比较（MTT法） 该实验中OD值反映了细胞存活数量，细胞抑制率反映了血清干预对细胞增殖的抑制强度。随着干预时间的延长，各组细胞OD值呈增长趋势，在48 h、72 h两个时点，两种含药血清组OD值均明显低于当时的对照组（P<0.05）；

说明干预48 h、72 h后，两种含药血清均能一定程度上抑制RA-FLS增殖。同一时间点不同含药血清组间比较，24 h后，DYD组OD值明显低于LEF组（P<0.05），提示DYD含药血清抑制细胞增殖作用起效较LEF组迅速；48 h后，两组OD值无明显差异（P>0.05）；72 h后，LEF组OD值中明显低于DYD组（P<0.05），提示

72 h末LEF含药血清的抑制效果较DYD组更强，见表1。

3.3 72 h后RA-FLS培养上清TNF-α含量的情况 对照组的TNF-α含量为134.22±13.21 pg·mL-1，DYD组为108.58±12.75 pg·mL-1，LEF组为98.36±

11.76 pg·mL-1。两种含药血清组细胞培养上清中TNF-α含量明显低于对照组（P<0.01），但LEF组和DYD组之间比较，差异无统计学意义

（P>0.05）。

4 讨 论

RA属中医学“历节”“痹病”范畴。《金匮要略·中风历节病脉证并治》对本病病机阐释为“寸口脉沉而细，沉即为肾，弱即为肝，汗出入水中……故曰历节”“风血相博，即疼痛如掣”，指明肝肾亏虚，气血不足是其发病的内在基础，风、寒、湿等外邪侵袭是外在诱因，作为该病病理产物的瘀血易与外邪缠结，痹阻经脉使肝血、肾精不能濡养筋脉、骨骼，最终导致筋伤骨损。林昌松教授秉承前述中医理论对RA的认识，在长期的临床实践中发现，岭南地区气候潮湿多风，风邪、湿邪是诱发加重RA症状的主要外在原因，而滑膜炎的持续与滑膜组织大量微血管弥漫性增生、充血、释放炎症因子密切相关，与中医学“瘀血致病”导致肿痛症状的机制有相通之处。因此，林昌松教授将岭南地区RA急性活动期的主要证型辨证为邪滞血瘀型，病机为“肝肾亏虚为本，风湿瘀阻为标”，并确立了“补肝肾、祛风湿、散瘀血”的治法，研制出断藤益母汤这一经验方。針对当地风邪、湿邪偏胜，该方以桂林产昆明山海棠（该药在岭南地区民间俗称为南蛇藤）为君药，取其祛风胜湿之功驱外邪；针对内生之邪瘀血，臣药选择益母草以化瘀消肿利水，针对肝肾不足筋骨失养的虚损方面，以补肝肾壮筋骨的川续断培补正气，同时，两味臣药的配伍有补益肝肾、活血通经以拮抗君药生殖毒性的寓意，全方正邪兼顾，切合病机。笔者等通过70例RA急性活动期患者的随机对照临床试验[4]证实，经过12周的治疗，口服DYD的试验组与口服LEF每日20 mg

的对照组患者在DAS28评分改善方面疗效相当。体外实验[5]证实，一定浓度的断藤益母汤含药血清可抑制RA-FLS增殖，其机制可能与该方含药血清下调脂多糖诱导的Toll样受体4的mRNA的表达、一定程度上抑制了RA-FLS的异常增殖状态相关，但该方含药血清是否对RA-FLS分泌的TNF-α有直接抑制作用尚不明确 。另有报道[6]川续断的有效组分续断皂苷具有一定程度的抗炎止痛和抗骨质疏松作用。研究证实，自古被视为妇科活血调经良药的益母草组分水苏碱有促进微动脉血流恢复、抗血小板聚集[7]的作用，可见断藤益母汤的抗RA作用也有一定现代药理学依据。

FLS是滑膜组织的主要组成部分，当它在各种诱因下异常活化为RA-FLS后，呈现出增生过度、凋亡不足的特征，直接导致滑膜增厚和血管翳的形成。同时，RA-FLS可产生或诱生一系列细胞因子、炎症介质，使病灶区滑膜组织聚集更多的炎症相关细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞等），维系了滑膜炎的持续以及软骨、骨组织的进行性破坏。而TNF-α即是在RA滑膜组织细胞大量分泌的炎症因子之一，对启动滑膜炎症和关节损害意义重大。它可协同白介素-1通过以下4方面参与RA病理过程[8]：①增强内皮细胞黏附分子表达，使血液中的白细胞向关节腔病灶区聚集；②刺激前列腺素等小分子炎症介质的产生；③激活破骨细胞，促进糖蛋白、胶原酶降解，导致骨质破坏；④促进软骨细胞和滑膜组织细胞产生大量白介素-6，后者有增强TNF-α和白介素-1效能的作用。此外，当病灶区细胞（含RA-FLS）分泌TNF-α达到一定浓度（10 ng·mL-1）可导致RA-FLS呈现持续过度增殖状态，可能与TNF-α使该RA-FLS表面具有抗细胞凋亡作用的TNFRⅡ基因表达上调相关。由此可见，RA-FLS及病灶区高浓度的TNF-α在RA复杂的细胞交互影响网络中发挥主导作用，抑制RA-FLS增殖和TNF-α的分泌是治疗RA的有效措施。

有研究显示，昆明山海棠水提取物可以抑制离体培养的RA-FLS增殖[4]，但水提取物的直接干预与口服药物经消化、吸收、代谢之后的成分可能不一致，二者对RA-FLS作用强度与起效机制是否存在差异也不明确。有效成分不清楚、药代动力学特点难以精确量化是中药复方实验研究进展艰难的关键问题，虽然起源于日本的血清药理学研究方法仍存在许多不足，但该方法的应用一定程度上模拟了中药起效的生理内环境，为中药复方在细胞信号转导的研究创造了有利条件。

本实验制取家兔含药血清干预第3代的人类RA-FLS，研究结果显示，一定浓度的DYD含药血清干预48 h即可以抑制RA-FLS的肿瘤样增殖，48 h末作用强度与LEF相当，72 h后抑制作用仍然存在但效果低于LEF。LEF是目前广泛使用的治疗RA常用药，口服后在肝内转化为活性成分M1，具有明确的抑制细胞增殖作用[7]，故制取该药含药血清作为阳性对照组，两种含药血清均能抑制RA-FLS分泌TNF-α，作用强度相当，这可能是两药共同的抗风湿作用机制之一。然而，DYD含药血清具体通过何种机制导致细胞增殖率降低、是否对细胞周期产生影响尚不明确，而两含药血清组TNF-α含量较对照组降低是源自细胞凋亡总体分泌量减少还是细胞分泌功能的减低也有待进一步深入研究探讨。

5 参考文献

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