魏晋五号壁画墓保存环境中空气微生物监测研究

俄军 武发思 汪万福 陈庚龄 赵林毅 贺东鹏 徐瑞红

内容摘要：本研究利用FA-I型便携式空气微生物采样器和分子技术，对魏晋五号壁画墓保存环境空气中可培养细菌和真菌的浓度、粒径分布、群落组成进行了监测和分析。结果表明：墓室内外空气中细菌、真菌微粒浓度差异极显著。分子鉴定与系统发生分析显示，墓室内外主要细菌类群组成相似，而真菌类群组成具有较大差异。放线菌、枝孢属、青霉属和链格孢属等大量存在于墓室空气中，成为威胁砖壁画保存的重要污染源。墓室内长期较高的相对湿度和较为封闭的保存环境，是引起小粒径微生物增殖的关键因素。建议阶段性地打开展览厅大门，增加墓室内外的空气交流。

关键词：魏晋墓；壁画；空气微生物；粒径分布；文物保护

中图分类号：K854.3；X83 文献标识码：A 文章编号：1000-4106（2013）06-0109-08

Monitoring and Research on Microbes in the Environment of the Wall Paintings

in No. 5 of the Wei and Jin Tombs

E Jun1 WU Fasi2，3，4，5 WANG Wanfu2，3，4，5 CHEN Gengling1

ZHAO Linyi2，3，4，5 HE Dongpeng2，3，4 XU Ruihong2，3，4

（1. Gansu Provincial Museum， Lanzhou， Gansu 730050； 2. National Research Center for Preservation of Ancient Wall Paintings and Earthen Sites， Dunhuang， Gansu 736200； 3. Key Scientific Research Base for Preservation of Ancient Wall Paintings （SACH）， Dunhuang， Gansu 736200； 4. Key Laboratory for Preservation of Ancient Wall Paintings and Earthen Sites in Gansu Province， Dunhuang， Gansu 736200；

5. Preservation Institute， Dunhuang Academy， Dunhuang， Gansu 736200）

Abstract： This paper introduces the monitoring and analysis of concentration， size， distribution， and community structures of the bacteria and fungi cultivable in the air of the environment of the wall paintings on the Wei and Jin tomb bricks with a portable airborne microbe sampler （FA-I） and molecular technology. As the research results indicate， the concentrations of the bacteria and fungi in the air inside and outside the tomb are extremely different. The molecular identification and phylogenetic analysis show that the community structures of the fungi inside and outside the tombs are similar， but the concentrations of the bacteria and fungi particles are very different. Actinomycetes， cladosporium， pinicielium， and alternaria exist in the tomb air in large number， and become an important pollution source threatening the preservation of brick paintings. The long-time higher relative humidity and closed environment of the tombs are key elements that cause the proliferation of fine-size microbe particles. Therefore， we suggest that the gate of the exhibition hall be opened periodically to increase air changes of the tombs.

Keywords： Tombs of Wei and Jin dynasties； Wall paintings on mural bricks； Microbes in the air； Size distribution； Preservation of cultural relics

（Translated by WANG Pingxian）

一 引 言

当前，对于文物保护的理念，已经从单纯的文物本身保护转变为对文物及其保存环境的预防性综合保护。影响文物保存的环境因子主要包括水分、温度、光照、大气以及生物因子，它们可独立或协同作用于文物，加速文物毁坏程度。就大气环境而言，气溶胶中大量的粉尘、有机分子和微生物孢子等多种成分，均会对文物构成潜在的威胁，如空气中飘浮的微生物孢子可以沉降在文物表面，当材料基质特征与周围环境中的温度与相对湿度满足沉积孢子体生长的营养和生态需求时，它们即可在文物上滋生、扩散，造成文物结构特征和美学价值的破坏[1-2]。

为了评估大气中的微生物成分，以及这些成分所引起历史遗址或考古文物材料破坏的危险性，在文物保护中对于遗址所在环境中空气微生物的监测显得尤为必要。国际空气生物学监测组织近期已将空气中可培养微生物数量（Clone Forming Unit， CFU）的监测列为文化遗产地环境监测的重要部分，其可以作为洞穴及墓室中微生物爆发的早期预测与环境控制的生态指标[3-4]。近年来，随着大气颗粒物采集技术和微生物鉴定技术的不断发展，对于洞穴、石窟寺和博物馆等文物保存环境中空气微生物的孢子含量、种类组成及其影响因素研究的报道也逐渐增多，所取得的研究成果为文物保存环境的安全性和空气质量评价提供了重要的参考依据[5-8]。

本研究以甘肃省博物馆馆藏魏晋五号壁画墓保存环境中空气微生物为监测对象，利用便携式FA-I型空气微生物采样器，通过基于培养和分子鉴定的技术手段，对墓室内外空气中可培养细菌和真菌的浓度、粒径分布和群落组成进行了统计与分析，旨在为砖壁画保存环境空气质量的判定提供依据，并为墓室砖壁画的后期保护提供建议。

二 材料与方法

（一） 样点简介

魏晋五号墓原址位于嘉峪关市东北 20 公里处的新城乡戈壁滩上，始掘于1972 年，为双室墓，总长7米左右。该墓葬于1973年完成考古发掘后即从嘉峪关整体搬迁至甘肃省博物馆进行异地保护，现为半地下式复原建筑，墓门外为斜坡式墓道，坡顶为陈列厅大门。墓室现对游客开放。墓室内画像砖除军事题材外，系统、真实地再现了魏晋时期当地百姓半耕半牧的经济生产和日常生活情景[9]，为研究河西地区的政治、经济、军事、文化、民族融合、生活方式、气候等提供了可靠的实物依据。

前期现状调查发现，砖壁画颜料层多处产生起甲、酥碱甚至剥落，部分砖壁画发生颜料变色，壁画表面存在微生物菌斑等多种病害（图1）。

（二） 样品采集

五号墓墓室内外环境中空气微生物实验样品，于2011年4月13日使用便携式FA-I型空气采样器进行采集。此型空气采样器是模拟人呼吸道的解剖结构和空气动力学特征，采用惯性撞击原理设计制造。采样器分为6级，每级400孔，从Ⅰ—Ⅵ级孔径逐渐变小，空气流速逐次增大，从而把空气中的带菌粒子按大小不同分别捕获在各级培养皿上。在每个采样点，采样器架设在距离地面1.5 m高的三脚架上。采样时空气流量为28.3 L/min，时间设定为3 min。采样器各层孔眼至采样面的距离（即撞击距离）为2 mm。每次取样均设立三个重复。采样过程中每次更换培养基时，均采用75%的酒精对采样器进行表面消毒处理，以减少样品污染。

（三）实验材料

实验中采用R2A培养基培养空气中的细菌微粒，马铃薯琼脂培养基（PDA）培养真菌微粒。本实验选择90 mm一次性无菌培养皿用于培养基的制备。培养基灭菌后在无菌条件下进行25 ml /皿的分装。培养基配制好后，经过48h空培养（37℃）以确定无污染后才可用于采样。

（四） 统计与分析

所有采集样品放至恒温培养箱中进行培养：细菌，37℃培养2—3天；真菌，25℃培养3—5天。根据采样器各级采样皿上菌落的克隆形成单位（Clone Forming Unit，CFU）记数，并经换算和公式校正，得到每立方米空气中细菌和真菌微粒的浓度[5]309-315。

通过对培养得到不同形态的菌落分离纯化，完成单菌落基因组DNA提取和PCR扩增。细菌样品以通用引物27F/1492R、真菌样品以引物ITS1/ITS4扩增。PCR产物经割胶纯化后，完成扩增片段的分子克隆和测序。所得序列在基因数据库GenBank中完成BLAST比对，用MEGA 4.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）中的双参数模型计算遗传距离，以邻接法（Neighbor-joining）、最大简约法和最小进化法推演系统发生关系，并将所测序列及与其相似序列进行遗传关系研究和群落组成分析。

所有实验数据用Excel2007和SPSS19.0进行编辑，两组数据间差异比较采用配对样本T检验，多组数据间比较经LSD检验后进行一维方差分析（ANOVA）。

三 结果与分析

（一）墓室内外可培养微生物数量分析

通过计算和统计分析，可以确定采样时五号墓墓室内外空气中，可培养细菌浓度分别为1091±99 CFU/m3、868±14 CFU/m3。墓室内空气中细菌孢子浓度，高于外部环境大气中浓度。但配对T检验分析后发现，二者间差异并不显著（P =0.127>0.05）。

魏晋五号墓墓室内、外环境空气中，可培养空气真菌浓度分别为675±39 CFU/m3、448±27 CFU/m3。墓室内空气中真菌孢子浓度，明显高于外部大气环境中浓度。配对T检验分析显示，二者间差异极显著（P =0.01>0.008）。

（二）墓室内外可培养微生物粒径分布

墓室内外环境空气中，可培养细菌在采样器各级上所占的比例存在较大差异（图2）。采样器第六级（孔径0.65—1.1μm）所占浓度百分比很低（<5%），表明该采样器可以实现对空气中细菌微粒的最大限度捕获。墓室空气中的细菌微粒主要分布在第三级（3.3—4.7μm）、第四级（2.0—3.5μm）和第五级（1.0—2.0μm），相当于总检测浓度的74.8%。其中第四级捕获到的微粒最高，达到总浓度的35.9%，与其他各级间存在极显著差异（P<0.01）。而在墓室外，细菌微粒主要分布在第一级（>7μm）、第三级和第四级，相当于总检测浓度的80.4%，其中第一级占到了总检测浓度的35.7%。并且，墓室内第四级与墓室外第一级间存在显著差异（P=0.03<0.05）。

墓室内外可培养真菌在采样器各级上所占的比例也不同（图3）。墓室空气中的真菌微粒主要分布在第三级、第四级和第五级，相当于总检测浓度的83.2%。其中第四级捕获的微粒最多，达到总浓度的50.6%，与其他各级间存在极显著的差异（P<0.01）。而墓室外环境空气中的真菌微粒主要分布在第二级（4.7—7μm）、第三级和第四级，相当于总检测浓度的76.2%。其中最高值出现在第四级，占到了总检测浓度的35.1%，与其他各级间差异显著（P<0.05）。

（三） 可培养微生物系统发生分析

墓室内、外空气中共分离纯化得到细菌菌株20个，分子鉴定显示，其隶属于3门9属。其中放线菌门（Actinobacteria）菌株数量最多，厚壁菌门（Firmicutes）次之，变形菌门（Proteobacteria）最少（图4）。BM-G6为墓室内空气中特有菌株，其隶属于动性球菌属（Planococcus）。棒形杆菌属（Clavibacter）、短小杆菌属（Curtobacterium）、壤球菌属（Agrococcus）、节细菌属（Arthrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、肉食杆菌属（Camobacterium）、动性杆菌属（Planomicrobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）在墓室内外均同时出现，表明两个采样点间细菌群落组成相似。

墓室内、外空气中共分离纯化得到真菌菌株20个，分子鉴定显示隶属于2门9属。其中子囊菌门（Ascomycota）菌株数量最多（15株），担子菌门（Basidiomycota）次之（图5）。墓室内外空气中真菌群落组成具有较大差异。FM-G1、FM-E1、FM-H4为墓室空气中特有菌株，其主要隶属于链格孢属（Alternaria）和青霉属（Penicillium）。FA-8H、FA-L5、FA-8G为墓室外空气中特有菌株，其主要隶属于锁掷酵母属（Sporidiobolus）、茎点霉属（Phoma）和匍柄霉属（Stemphylium）。Davidiella、枝孢属（Cladosporium）和隐球菌属（Cryptococcus）为共有属，其中枝孢属为共有优势属。

四 讨 论

（一） 可培养微生物浓度

墓室内空气中微生物浓度整体高于墓室外环境，二者间细菌孢子浓度差异不显著，而真菌孢子浓度差异极显著。已有环境监测研究表明，该墓室内相对湿度在春、夏、秋季一直维持在70%—85%之间[10]。同时，墓室前室西壁存在一定程度的地下水渗漏，较高的相对湿度成为微生物增殖的前提条件。另外，墓室展览厅大门长期关闭，墓室内外空气交换缓慢。在这些因素的共同作用下，造成墓室内部空气微生物浓度高于外部。

根据我国室内空气质量标准[11]，公共场合室内空气中细菌浓度不得超过2500 CFU/m3，五号墓砖壁画保存环境中空气微生物浓度尚在国标规定的范围内。然而，根据最新的洞穴环境生态干扰分级标准，当具有岩画的洞穴空气中真菌浓度达到500—1000 CFU/m3时，表明游客参观等外部因素已经影响到了洞穴环境的稳定性[4]1594-1598。与本研究比较而言，敦煌莫高窟洞窟内外真菌浓度分别为190—300 CFU/m3、170—310 CFU/m3，微生物浓度在窟内高于窟外，游客活动及相对封闭的内部环境容易造成洞窟内微生物孢子体的富集[5]309-315[6]461，466。其他研究表明，在参观人数为400人/h的情况下，世博会展馆内微生物气溶胶产生量达到44，000 CFU/h·m3 [12]。人体表皮的脱落、代谢、排泄物及所携带的微生物都会成为气溶胶中微生物的污染源，正常人在静止状态下平均每分钟可向环境散发50—1500个菌粒，活动时排放菌粒多达数千至数万，呼吸和说话都会向周围环境中排放大量的微生物[13]。本研究中，五号墓墓室内空气中真菌浓度已达到675±39 CFU/m3，表明环境的稳定性已经受到了较大程度的影响，因此建议博物馆管理人员采取间歇性通风透气等措施以增加墓室内外的空气交换，稀释墓室内空气微生物浓度。

研究发现，空气微生物受外环境因素影响较大，同时会呈现出明显的时空动态变化特征，通过检测空气微生物可以确定环境气溶胶中微生物的污染源，对于保护文物及其附存环境具有重要作用[14]。因此，有必要建立遗产地及博物馆环境中微生物的时空动态监测体系，以确定不同时间段和游客参观对文物保存环境中空气微生物浓度和群落结构的影响，进而为旅游开放和文物保护提供科学依据。

（二）可培养微生物粒径

空气微生物在采样器各级上的捕获情况，可以反映出空气的质量状况。墓室内环境中，采样器第四级捕获到了较多的细菌微粒，表明墓室内多数携带细菌孢子的微粒都较小；而第一级采样器在墓室外捕获到了较多的细菌微粒，这与当地城市空气质量较差、污染颗粒物较大较多存在一定的关联。如在北京外交通干线环境空气中的细菌粒子主要分布在采样器前4级（>2μm）中，最高值高峰分布在第一级（>8.2μm）中[15]。细菌微粒大多吸附于尘埃粒子表面，由于重力的作用，较大的粒子易沉降于近地面。

墓室空气中的真菌微粒主要分布在采样器的第二—四级，其中最高值出现在采样器的第四级。与之相似，莫高窟空气中真菌微粒主要分布在采样器的第二—四级[6]461-466 [16]。墓室内外主要真菌微粒的分布范围差异较小，ANOVA分析显示，除第四级（P=0.00<0.01）外，其他各级之间差异均不显著（P>0.05）。由此可知，造成墓室内浓度增加的真菌微粒较小，主要分布在采样器第四级。在外环境中真菌浓度较低的情况下，所增加的真菌微粒是粒径较小的真菌孢子在墓室内长期增殖的结果。

（三） 可培养微生物群落组成

本研究中，墓室内外空气中分离纯化得到的放线菌门类群数量最多。有报道称，在地下洞穴、墓室或石窟环境中，壁画首先会遭受到链霉菌属和诺卡氏菌属等放线菌家族成员的腐蚀，它们成为微生物在壁画表面繁殖的先锋种群[17]。近期研究发现，在莫高窟洞窟空气内也分离得到了大量的放线菌门节杆菌属（Arthrobacter）菌株[18]。其次，墓室内空气中特有细菌主要隶属于动性球菌属，特有真菌主要隶属于链格孢属和青霉属。事实上，链格孢属和青霉属也是微生物污染壁画上分离得到最多的真菌类群[19]。五号墓墓室空气中极其丰富的放线菌、青霉、链格孢菌等已成为砖壁画发生微生物腐蚀的重要污染源。

枝孢属为五号墓墓室内外空气中的优势属。有调查发现，其在莫高窟洞窟内外空气中同样占据着相对优势[16]13-18。已有研究表明，枝孢霉对壁画制作材料骨胶具有较强的降解作用，可以促进铅丹向铅白的转化[20]。因此，有必要阶段性地打开墓室展览厅大门，控制砖壁画保存环境中温、湿度，避免墓室内空气中悬浮的放线菌和枝孢霉等有害微生物孢子因适宜的温、湿度而在砖壁画表面滋生、蔓延，造成砖壁画变色和破坏。

五 结论及建议

通过对魏晋五号墓砖壁画保存环境空气微生物浓度、粒径分布和群落组成的分析，主要得到以下结论：

1. 五号墓墓室内可培养空气微生物浓度高于墓室外部，其中真菌微粒浓度差异极显著。

2. 细菌微粒在墓室内主要分布在粒径1.0—4.7μm，在墓室外主要分布在粒径>7μm与2—4.7μm的范围内；而真菌微粒在墓室内外均大量分布在粒径2.0—4.7μm的范围内。

3. 墓室内外可培养细菌群落组成相似，可培养真菌群落组成差异较大。墓室空气中极其丰富的放线菌、枝孢属、青霉属、链格孢属成员等已成为砖壁画发生微生物破坏的危险污染源。

4. 空气微生物的监测在墓室微生物爆发的早期预测方面具有重要的指示作用。

综上，墓室内长期较高的相对湿度和较为封闭的保存环境是造成小粒径细菌和真菌微粒增殖的关键因素。建议控制参观游客流量和滞留时间，同时在天气晴好干燥时，阶段性地打开展览厅大门，保证墓室内外的空气交流，避免有害空气微生物孢子大量增殖后危害到砖壁画的安全保存。

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