乌龙丹对大鼠胶原诱导性关节炎的影响

李泽光 梁华 黄吉峰 刘婷婷 佟颖 朴勇洙 李奇玮 李娟 黄蓉

【摘 要】目的：通过观察乌龙丹对胶原诱导性类风湿关节炎模型大鼠的影响，探讨乌龙丹抗类风湿关节炎的作用及其机制。方法：对Ⅱ型胶原诱导性大鼠建立类风湿关节炎模型，通过测定关节炎指数积分、关节肿胀率变化情况，评价乌龙丹的治疗作用，并以Elisa法检测血清及滑膜液中白细胞介素-1β、白细胞介素-6、转化生长因子-β1、白细胞介素-17F、基质金属蛋白酶-3表达情况，分析并探讨其作用机制。结果：乌龙丹各治疗组可明显降低模型大鼠关节炎指数积分，血清及滑液中白细胞介素-1β、白细胞介素-6、转化生长因子-β1、白细胞介素-17F、基质金属蛋白酶-3均有不同程度下降，其中以中剂量组下降最为显著。结论：乌龙丹对胶原诱导性类风湿关节炎模型大鼠关节炎具有良好的治疗作用，其机制可能是通过调节关节滑液及血清中白细胞介素-1β、转化生长因子-β1含量，抑制了CD4+T细胞向Th17细胞分化，从而阻断了白细胞介素-1β、白细胞介素-17F、基质金属蛋白酶-3等因子的生物学效应而达到阻止或延缓类风湿关节炎炎症和关节破坏的作用。

【关键词】 乌龙丹；白细胞介素；转化生长因子-β1；基质金属蛋白酶-3；实验研究；大鼠

The Influence of Wulongdan on Rats with Collagen-Induced Arthritis

Li Ze-guang，Liang Hua， Huang Ji-feng，Liu Ting-ting，Tong Ying，Piao Yong-zhu，Li Qi-wei，Li Juan，Huang Rong

【ABSTRACT】 Objective：To explore the effect and mechanism of Wulongdan on rheumatoid arthritis through observing the influence of wulongdan on rat model with collagen-induced arthritis.Methods：The rat model with rheumatoid arthritis was established by collagen type II，evaluating therapeutic effect of wulongdan by measuring arthritis index score and changes of joint swelling rate and analyzing and exploring its mechanism by measuring with elisa method the expression of interleukin-1β in serum and synovial fluid，interleukin-6，transforming growth factor-β1，interleukin-17F and matrix metalloproteinase-3.Results：Wulongdan in the treatment group could obviously reduce the arthritis index score of rat model，and at the same time interleukin-1β in serum and synovial fluid，interleukin-6，transforming growth factor-β1，interleukin-17F and matrix metalloproteinase-3 decreased in various degrees，among which above factors in the middle dose group decreased significantly.Conclusion：Wulongdan had good therapeutic effect on collagen-induced rheumatoid arthritis in rats，whose mechanism may be through the regulation of interleukin-1β in serum and synovial fluid，interleukin-6，transforming growth factor-β1，interleukin-17F and matrix metalloproteinase-3 to prevent or delay the rheumatoid arthritis and joint destruction.

【Key words】 wulongdan；interleukin；transforming growth factor-β1；matrix metalloproteinase-3； experimental study；rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的关节滑膜组织是一种具有很强侵蚀作用的病变组织，其生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性：滑膜组织表现为增生性侵蚀性生长，滑膜组织肥厚，血管翳形成。近年来研究表明，Th17在自身免疫病中发挥重要作用，其分泌的细胞因子白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）是参与RA滑膜病变中的重要细胞因子，促进了关节炎症的发展和关节破坏的发生，也有可能作为临床判断RA活动性的指标之一，成为RA生物治疗的新靶向[1]。我们在临床RA的治疗中应用乌龙丹获得了良好的疗效，为了探讨其治疗RA的机制设计了如下实验。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠（由黑龙江中医药大学实验动物中心提供）50只，体质量为（l90± 20）g，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要试剂及药品 牛Ⅱ型胶原（typeⅡcellegan of bovine，BCⅡ）与弗式完全佐剂购于sigma公司。白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）Elisa试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。基质金属蛋白酶-3（MatrixMetalloproteinase3，MMP-3）、IL-17F Elisa试剂盒购于美国R&D公司。乌龙丹由乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川断、木瓜、威灵仙组成（由黑龙江中医药大学药学院国家中药材规范化生产及质量标准实验室提取制备，1 g浸膏相当于生药5.3 g）。

2 方 法

2.1 BCⅡ乳剂制备 在无菌条件下用0.1 mL·L-1冰醋酸充分溶解BCⅡ，浓度为4 mg·mL-1，置4 ℃冰箱过夜后，与弗氏完全佐剂等体积混合，振荡乳化，制成BCⅡ乳剂（即每0.5 mL含1 mg BCⅡ）。

2.2 模型建立 取Wistar雄性大鼠，随机选出10只为正常组。其余大鼠于颈、背部5个部位皮内注射BCⅡ乳剂总量0.5 mL（含1 mg BCⅡ）。第21天0.3 mL加强注射，方法同上。

2.3 分组及处理 将造模成功的大鼠随机分为模型组，乌龙丹高、中、低剂量组4个组，每组10只。乌龙丹高、中、低剂量组分别给予14 g·kg-1、7 g·kg-1、3.5 g·kg-1生药，每次1 mL，每日灌胃1次；正常组与模型组予等容量蒸馏水；各组均于造模第10天开始给药，共给药28 d。

2.4 取 材 给药第28天，脱颈法处死大鼠，由眼眶取血，离心分离血清，同时以镊子拉开足-踝关节，使关节腔增大，以含1 mL蒸馏水注射器反复冲洗关节腔吸取关节滑膜液。

2.5 实验数据采集与测定

2.5.1 关节炎指数积分 采用Wood氏关节炎评估标准，4只足爪中每只足爪的损害都分为0～4级，计算四肢的总积分，最高的分数为16分，给药后每7天评估积分1次，并进行记录。具体评分标准如下，0分：正常；1分：红肿涉及1个指关节；2分：红肿涉及2个以上指关节或整个足爪轻度红肿；3分：足爪红肿较重；4分：足爪重度红肿，缺乏弹性。

2.5.2 关节肿胀率测定 造模后用水溶积置换法测定大鼠致炎侧即左踝关节毛际以下容积。以第1天测得的值为基值，给药28 d后测得的值与之相比所得比值为关节肿胀率。

2.5.3 IL-1β、IL-6、IL-17F、TGF-β1、MMP-3含量测定 采用Elisa双抗夹心法测定血清及滑液中IL-1β、IL-6、IL-17F、TGF-β1、MMP-3含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.6 统计学方法 所有数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，结果用表示，采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 模型组后肢肿胀情况 本实验中我们观察到Wistar大鼠在皮下注射BCⅡ乳剂后，于第14天时可见关节肿胀明显，见图1。以后肢远端显著，至第20天时关节肿胀达到了最高峰，与文献报道情况相一致，见图2。

图1 造模后第14天

图2 造模后第20天

3.2 各组大鼠关节炎指数积分比较 模型组关节炎指数积分于给药后1～2周（即造模后第17～24天）最高，之后逐渐降低，与同时期乌龙丹各治疗组相比较，关节炎指数积分明显增高，差异有统计学意义（P < 0.01）；中药组高中低剂量组之间比较，中剂量组对关节炎指数积分降低效果最好，且各时期与低剂量组和高剂量组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），见表1。

3.3 各组关节肿胀率变化情况比较 模型组关节肿胀率显著升高，乌龙丹各剂量组与模型组比较，关节肿胀率均有明显降低，差异有统计学意义

（P < 0.01）；乌龙丹各剂量组间比较，高、中剂量组优于低剂量组，中剂量组与低剂量组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），高剂量组与低、中剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。

3.4 各组大鼠血清及滑液IL-1β、IL-6、TGF-β1、IL-17F、MMP-3表达情况 模型组血清及滑液中IL-1β、IL-6、TGF-β1、IL-17F、MMP-3均有明显升高，与正常组比较具有显著性差异；各治疗组均有不同程度的改善，与正常组相比仍显著升高，TGF-β1血清中改善不明显，与模型组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），其余指标与模型组比较，均有统计学意义（P < 0.01），其中以乌龙丹高、中剂量组差异最显著，见表3、表4。

4 讨 论

RA是一种以滑膜炎和关节破坏为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，多种细胞因子参与了这一过程，近年来国内外研究着认为Th17细胞与及其分泌的IL-17在RA发生、发展中起到了重要的作用[1]。

Bettelli E等[2]研究表明，当CD4+T在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-6 的共同诱导下，诱导分化为（下转第38页）

（上接第31页）Th17细胞，参与自身免疫病。当TGF-β单独存在时并不能诱导初始型T细胞向Th17细胞分化，而是向Foxp3+T细胞（REG）分化。

Th17细胞在RA患者模型病灶部位高表达，并与疾病的严重程度相一致[3]；主要效应因子是IL-17。IL-17有多个亚型，Th17细胞分泌的是IL-17A和IL-17F。IL-17在RA滑液中含量不多，但相对功能较强[4]。滑膜中T细胞来源的IL-17能通过活化滑膜细胞与IL-1产生协同作用，分泌MMP-3和其他促炎因子。IL-17还通过增强破骨细胞的活性参与骨侵蚀[5]。在类风湿性关节内，IL-1诱导成纤维细胞增生，通过滑膜细胞刺激II-6的生物合成，IL-1还能在成纤维样滑膜细胞及内皮细胞中产生大量黏附分子，并增加骨吸收。MMP-3被证实是在包括RA在内的多种关节炎及其关节破坏的重要因素之一[6]。一项来自日本的研究证实MMP-3能作为关节破坏的预测因子[7]。

本实验发现，模型组实验动物血清与滑膜液中IL-6、TGF-β1含量均有显著升高，同时IL-17F表达亦显著升高，这一结果与文献报道相一致。通过乌龙丹干预后，各给药组大鼠IL-1β、IL-6、TGF-β1、IL-17F、MMP-3表达均有不同程度的降低。

RA属中医学 “尪痹” “历节” “鹤膝风”等范畴。其病因病机主要是由于正气亏虚、寒热错杂、痰瘀毒壅阻经络，损害筋骨关节，导致骨质侵蚀和骨质疏松。近年来本院在临床实践中以此理论为指导，并开发出乌龙丹制剂，以乌龙丹为基本方治疗RA取得了满意的疗效。其中乌骨藤味微辛、涩，性温，归肝经，祛风湿、活血、解毒；穿山龙性平、味苦，归肝肺经，祛风除湿、活血通络。两药共凑祛风湿、活血通络、解毒，为君药。杜仲味甘、性温，归肝、肾经，补肝肾，强筋骨；川续断苦辛、微温，入肝、肾经，补肝肾，续筋骨，调血脉。共凑补肝肾、强筋骨，助君药祛风湿、除痹痛，共为臣药。佐以白芍养血、止痛、敛阴；木瓜舒筋活络、和胃化湿；秦艽祛风除湿、和血舒筋、清热；威灵仙祛风除湿，通络止痛。全方共凑祛风湿、补肝肾、通络解毒之功效。

通过本实验我们发现，乌龙丹可能是通过调节关节滑液及血清中IL-6、TGF-β1含量，抑制了CD4+T细胞向Th17细胞分化，从而阻断了IL-1β、IL-17F、MMP-3等因子的生物学效应而达到阻止或延缓RA关节炎和关节破坏的作用，这可能是其取得临床疗效的机制之一。

5 参考文献

[1] 段发兰，李亚新，胡筱梅，等.活动期类风湿关节炎患者血清及关节液白细胞介素17水平变化及与有关实验室指标的关系[J].微循环学杂志，2011，21（1）：42-43，46.

[2] Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al.Reciprocal develop-mental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature，2006，441（7090）：235-238.

[3] 郑莎莎，李小峰，王彩虹，等.类风湿关节炎患者Th17细胞水平变化的研究[J].中国医疗前沿，2011，6（5）：5-6.

[4] Chabaud M，Durand JM，Buchs N，et al.Human interleukin-17： A T cell-derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium[J].Arthritis Rheum，1999，42（5）：963-970.

[5] Lubberts E，Joosten LAB，Chabaud M，et al.IL-4 gene therapy for collagen arthritis suppresses synovial IL-17 and osteoprotegerin ligand and prevents bone erosion[J].J Clin Invest，2000，105（12）：1697-1710.

[6] Ogata K，Amano K，Kato H，et al.Matrix metallo-proteinase （MMP）-3 is not effective for evaluating hemophilic arthropathy[J].Rinsho Byori，2011，59（1）：37-41.

[7] Mamehara A，Sugimoto T，Sugiyama D，et al.Serum matrix metalloproteinase-3 as predictor of joint destruction in rheumatoid arthritis，treated with non-biological disease modifying anti-rheumatic drugs[J].Kobe J Med Sci，2010，56（3）：98-107.