罗格列酮诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的机制研究

李艳丽

【摘 要】目的：研究罗格列酮对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响及其机制。方法：MTT法检测RGZ处理Hela细胞后的增殖活性并绘制生长抑制曲线。流式细胞仪检测Hela细胞凋亡率，Wstern检测Hela细胞Survivin和Livin蛋白表达的变化。结果：RGZ能呈剂量依赖性和时间依赖性的抑制Hela的增殖（P<0.01）。流式细胞仪检测发现以RGZ处理Hela细胞后细胞凋亡率呈剂量依赖性上升 （P<0.01）。Western检测发现Hela细胞Survivin和Livin蛋白表达显著下降 （P<0.01）。结论：RGZ能抑制宫颈癌Hela细胞增殖和并诱导凋亡，其作用机制与下调Survivin和Livin蛋白表达有关。

【关健词】宫颈癌；增殖；凋亡

宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤的第二位，严重威胁着妇女的生命和健康。虽然发达国家已经成功地降低了宫颈癌的发病率和死亡率。但在很多发展中国家，宫颈癌仍然是这些地区主要的恶性肿瘤之一，资料显示，每年有超过50万的宫颈癌新发病例，其中90%来自发展中国家[1]。目前虽然宫颈癌的治疗取得了较好的临床效果，但预后仍有较多不尽人意之处。因此，寻找行之有效的化疗药物具有十分重大的意义。罗格列酮（Rosiglitazone，RGZ）为临床常用的糖尿病治疗药物，近年来研究发现它能抑制乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖，但尚未见其对人宫颈癌细胞系作用的报道。本文旨在研究RGZ对人宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其抗肿瘤活性的机制，为其临床应用提供参考依据。

1材料和方法

1.1材料

人宫颈癌Hela细胞株购自购于中科院上海细胞库。DMEM培养基和新生牛血清购自美国Invitrogen公司。罗格列酮（Rosiglitazone，RGZ）购自葛兰素史克公司公司。UA和碘化丙啶 （propidium iodide，PI）染料和噻唑蓝（MTT）及二甲基亚砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）试剂购自Sigma公司。Survivin和Livin及β-actin抗体均购自Santa Cruz。辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG（二抗）和碱性磷酸酶显色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和药物处理

Hela细胞接种于含10%新生牛血清的DMEM培养基（含100 u/ml青霉素和100 u/ml链霉素）中，37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中传代培养。

1.2.2MTT法检测RGZ对Hela细胞生长的抑制作用

取对数生长期的Hela细胞按200μl/孔细胞悬液（1×105个细胞/ml）接种于96孔板。加入RGZ终浓度为12.5、25、50、100μmol/L的DMEM完全培养基，同时设阴性对照和空白对照，每组均设3个复孔，继续培养24、48、72h。培养结束前4h每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl。终止培养，弃上清，每孔加入DMSO 150μl震荡10分钟，酶联免疫检测仪上于570nm波长检测各孔吸光度值（A值）。细胞生长抑制率=（对照组A值-给药组A值） /对照组A值×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡细胞

收集12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后的Hela细胞，轻轻吹打制备单细胞悬液细胞。细胞悬液移入离心管，4℃，500×g，离心5min。弃上清液，冰预冷PBS洗细胞2次。上流式细胞仪双染检测凋亡计算细胞凋亡率。

1.2.4 Western蛋白印迹法检测RGZ对Hela细胞Survivin和Livin蛋白表达表达的影响

收集12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后的Hela细胞，提取细胞总蛋白。SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至PVDF膜上。加一抗抗体静置过夜，TBST漂洗，加入二抗孵育后荧光显色，冲洗。

1.3统计学分析

数据应用SAS 6.12和SPSS 13.0统计软件进行处理，检验水准为α=0.05。

2结果

2.1 RGZ对Hela细胞增殖的影响

RGZ具有显著抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的作用，呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性；不同浓度组间、不同时间组间生长抑制率均有显著性差异（F=28.205，P<0.01）（图1）。

图 1 RGZ抑制细胞生长的时效和量效关系

2.2 RGZ对Hela细胞凋亡率的影响

空白对照组的Hela细胞的凋亡率较低，经12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后，细胞凋亡率分别为5.3±2.96、11.85±3.72、16.05±3.91、24.83±4.46。与对照组1.22±0.94相比，不同浓度组间细胞凋亡率有显著性差异（F=11.322，P<0.01）（图2）。

图2 不同浓度RGZ作用后Hela细胞凋亡率分析

2.3 RGZ对Hela细胞Survivin和Livin蛋白表达表达的影响

经12.5、25、50、100μmol/L RGZ RGZ作用24h后Hela细胞Survivin蛋白表达明显降低，分别降低至0.84±0.09、0.67±0.07、0.49±0.12、0.28±0.14，与对照组的0.95±0.13比较，不同浓度组间有显著性差异（F=10.201，P<0.01）；Hela细胞Livin蛋白表达明显降低，分别降低至0.76±0.13、0.63±0.1、0.49±0.11、0.34±0.14，与对照组的0.81±0.11比较，不同时间组间有显著性差异（F=16.135，P<0.01）。

图3 不同浓度RGZ作用后Hela细胞Survivin和Livin蛋白的表达

3讨论

近年来研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ）的特异性配体能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖，其中在肺癌和前列腺癌患者的临床治疗中，PPARγ配体已表现出了良好的抑瘤效果[2]。罗格列酮属噻唑烷二酮类药物（thiazolidinediones，TZDs）是PPARγ激动剂，对PPARγ亲和力大，特异性强，且毒副作用轻，近年研究显示，罗格列酮能诱导多种肿瘤细胞的终末分化，其机制可能是阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭及血管生成等[3-4]。目前尚未见其对人宫颈癌细胞系作用的报道。本文旨在研究RGZ对人宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其抗肿瘤活性的机制，为其临床应用提供参考依据。本研究证实RGZ对人宫颈癌Hela细胞有显著的增殖抑制作用并呈浓度和时间依赖性。本实验还观察了RGZ对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响：流式细胞仪可发现RGZ作用后宫颈癌Hela细胞的凋亡率高于对照组，成时间依赖性上升，表明RGZ可有效地诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡。

本研究结果认为RGZ能够抑制人宫颈癌Hela细胞的生长，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。作为重要的免疫营养物质，RGZ在肿瘤研究中有着重要的作用，但其作用途径和机制，尚需进一步研究。

参考文献：

[1] Holley JL. Screening， diagnosis， and treatment of cancer in long-term dialysis patients[J]. Clin J Am Soc Nephrol， 2007， 2（3）：604-10.

[2] Espadinha C， Pinto AE， Leite V. Underexpression of PPARgamma is associated with aneuploidy and lower differentiation of thyroid tumours of follicular origin[J]. Oncol Rep， 2009， 22（4）：907-13.

[3] Yang SJ， Choi JM， Chae SW， et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma by rosiglitazone increases sirt6 expression and ameliorates hepatic steatosis in rats[J]. PLoS One， 2011， 6（2）：e17057.

[4] Kim SL， Kim EM， Cheong SJ， et al. The effect of PPAR-gamma agonist on （18）F-FDG uptake in tumor and macrophages and tumor cells[J]. Nucl Med Biol， 2009， 36（4）：427-33.