荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果探讨

赵琪林

【摘 要】目的：为进一步提高本单位在使用荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸方面的检验水平。方法：对本单位的荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控考核结果进行分析。结果：在本次质控考核实验中，检出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根据分子生物考核操作标准，本单位使用荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸方面的检验情况合格。结论：荧光实时定量PCR法在检测流感病毒核酸方面具有广泛的应用空间，可以为一些突发性公共性事件的检验提供准确的数据，值得进一步推广。

【关键词】荧光实时定量PCR法；流感病毒核酸；质控

荧光实时定量PCR法的临床应用，最大程度改善了传统PCR法特异性不强、污染的问题，并通过电脑软件的配合性应用[1]，实现了在每一轮循环都可检测出一次荧光信号强度，进而获得标准曲线获得定量的检测结果。目前，荧光实时定量PCR法在临床疾病诊断、动物疫病检测、食品安全等领域已经发挥出重要作用。为进一步提高本单位在使用荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸方面的检验水平。本文特对本单位的荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控考核结果进行分析。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料 流感病毒灭活抗原标本三份、流感病毒RNA提取液、流感病毒核酸荧光PCR法检测试剂盒（甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒）、流感病毒核酸荧光PCR法检测1?l9混合液、1?l混合酶、5?l处理完毕样本，25?l反应体系。实时定量荧光检测仪（型号为7300）、冷冻离心机（型号为38R）。

1.2 方法

1.2.1 实验操作标准 参照分子生物考核操作标准[2]、荧光实时定量PCR法操作规程流程进行实验操作。

1.2.2 具体实验步骤

1.2.2.1 提取流感病毒核酸RNA 将流感病毒裂解液500?l和流感病毒培养液100?l加入到1.5ml离心管中，混合充分后加入乙醇溶液（70%）600?l，取出RNA提取柱将600?l混合液加入，使用冷冻离心机进行15秒离心处理，设定离心速率为（12000rpm），弃去收集管液体[3]，在进行15秒离心处理，设定离心速率为（12000rpm），再弃去收集管液体，加入清洗液RW1700?l，进行15秒离心处理，设定离心速率为（12000rpm），取一干净收集管移取RNA提取柱，在柱中加入清洗液RPE500?l，进行15秒离心处理，设定离心速率为（12000rpm），弃去收集管液体，再次加入清洗液RPE500?l，进行3分钟离心处理，设定离心速率为（13000rpm），取出提取柱，移到一支1.5ml干净离心管中，在柱中加入无核糖核酸酶水50?l，在20摄氏度室温下放置2分钟后，进行1分钟离心处理，设定离心速率为（12000rpm），抛弃提取柱，即得流感病毒核酸RNA，在20摄氏度下保存待用。

1.2.2.2 扩增 流感病毒甲1型核酸荧光PCR法检测19?l混合液、1?l混合酶、5?l处理完毕样本，25?l反应体系，选择VIC荧光检测通道[4]。流感病毒甲3型核酸荧光PCR法检测19?l混合液、1?l混合酶、5?l处理完毕样本，25?l反应体系和流感病毒乙型核酸荧光PCR法检测19?l混合液、1?l混合酶、5?l处理完毕样本，25?l反应体系选择FAM荧光检测通道。扩增时，注意盖好PCR反应盖，设定PCR扩增反应的条件[5]为：10分钟45摄氏度—15分钟95摄氏度15秒、60摄氏度60秒循环，反复循环扩增50次，根据基线最后取3个到15个循环荧光信号值。

1.2.2.3 结果判定标准 当Ct阈值大于等于40时表示结果为阴性，当Ct阈值小于40时表示结果为阳性。

2结果 在本次质控考核实验中，检出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根据分子生物考核操作标准，本单位使用荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸方面的检验情况合格。

3讨论

荧光实时定量PCR法，是指在PCR的反应体系中加入特有的荧光基团，通过对荧光信号的实时积累信号检测对PCR反应过程进行有效监测，再使用相应电脑软件进行标准曲线的绘制，最终达到对制定目标的定量分析。荧光实时定量PCR法的临床应用显著提高了传统PCR法检测的缺点，经临床使用发现具有快速、稳定、安全、操作简便、重复性高的诸多优点，由于其整个实验过程都是在一个相对封闭环境中进行的，所以大大降低了污染的风险。但是在实践操作中我们也发现，荧光实时定量PCR法也存在一定显著的缺点，例如：对实验操作的要求比较高，需要操作人员数量掌握相关原理、步骤、要点，并且影响实验的因素也比较多，需要环境温度等因素相对稳定，此外实验成本比较高，在基层普及中存在一定困难。分析本次质控考核实验结果，本次试验检出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根据分子生物考核操作标准，本单位使用荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸方面的检验情况合格。其中流感病毒乙型核酸未被检测出来，分析原因认为和实验试剂浓度有一定关联，但需要进一步验证。综上所述，荧光实时定量PCR法在检测流感病毒核酸方面具有广泛的应用空间，可以为一些突发性公共性事件的检验提供准确的数据，值得进一步推广。

参考文献：

[1] 龙春平，孔令军，吴周建，荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果分析[J]，中国卫生检验杂志，2008，18（6）：1107—1108.

[2] 张弛宇，李全双，孙金燕，等，荧光实时定量PCR的研究进展[J]，江苏大学学报，2006，16（3）：268—270.

[3] 罗淑华，黄胜中，李宇聪，等，荧光实时PCR检测法在突发公共卫生事件的应用[J]，中国卫生检验杂志，2008，18（12）：2611—2754.

[4] 刘继峰，关翠萍，徐田红，等，单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立[J]，医学研究杂志，2008，37（12）：36—38.

[5] 陶志华，谢耀盛，陈晓东，等，不同标本对荧光实时定量PCR法测定HBV-DNA结果的影响[J]，临床检验杂志，2001，19（6）：345—346.