HLA—DRB1等位基因分型与青海藏族类风湿关节炎相关性研究

张培莉等

【摘 要】目的：探讨HLA-DRB1等位基因在中国青海藏族类风湿关节炎患者的分布及意义。方法：采用PCR-SSP（聚合酶链反应-序列特异性引物法）技术，对87例RA患者和90例正常对照的HLA-DRB1*01，04基因型进行检测。结果：HLA-DRB1* 04，在RA组的频率显著高于正常对照组（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在两组差别无显著意义（P =0.621）。结论：HLA-DRB1位点在青海地区藏族类风湿关节炎患者中的分布具有丰富的多态性， HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因。

【关键词】类风湿关节炎；HLA-DRB1基因；等位基因；藏族

类风湿关节炎（ Rheum ato id Arthr itis， RA ）与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR基因在遗传上的联系在20世纪70年代被首先报道，研究人员发现HLA-DR4在70%的RA患者中出现，而在对照组中仅30%，具有 HLA-DR4基因的个体患RA的相对危险性大约为4-5倍。[1]

基于国内诸多学者对中国不同地区汉族RA人群HLA-DRB 1等位基因的研究，本研究在RA相关HLA-DRB1等位基因在全世界不同人种、不同种族中生物地理区分布不同的基础上，测定青海地区藏族人群RA病人中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因的分布，探讨青海地区藏族人群中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因与RA发病相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

RA 组为2011年10月至2012 年8月于青海大学附属医院、青海省人民医院及青海省藏医院就诊的青海地区居住5年以上且无血缘关系的藏族人群RA 患者。其诊断依据为2010年ACR/EULAR联合颁布新的RA诊断标准。男性21 人，女性66人，平均年龄（44.4±14.2）岁，对照组为青海地区居住且无血缘关系的藏族健康体检人群 男性19人，女性71人，平均年龄（45.4±14.6）岁。两组均为藏族，排除其它自身免疫性疾病和严重心、肝、肾疾病，经统计学检验两组人员年龄、性别差异无统计学意义，均符合Hardy–Weinberg平衡定律。

1.2 研究方法

1.2.1样本采集：收集所有研究对象清晨空腹静脉血7 mL， 其中2 mL贮于EDTA抗凝的试管中，-20℃保存， 用于基因组DNA的提取。

1.2.2基因组DNA的抽提： 采用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒（赛泰克生物科技有限公司），利用其独特的细胞裂解和血红素/蛋白沉淀技术， 结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法，从抗凝全血中得到并纯化基因组DNA， DNA样本保存在-20℃备用。

1.2.3 HLA-DRB1* 04， 01等位基因的检测：

采用PCR SSP法，按文献合成引物序列：DRB101-F TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT，DRB101-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，产物长度 255bp；DRB104-F GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA，DRB104-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，产物长度 260bp；hGH-F GCCTTCCCAACCATTCCCTTA，hGH-R TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC，产物长度 429bp。PCR扩增反应体系：2.5×Buffer V 6.0?l，目的基因上下游引物（5?M）各1.0?l，内参基因上下游引物（5?M）各0.4?l，KAPAHS Taq酶（5U/?l）0.1?l，模板DNA 1.0?l，ddH2O 6.5?l。反应程序如下： 95℃ 10 min； 95℃ 30 s， 58℃ 60 s， 72℃ 60 s， 共35個循环； 72℃ 10 min，终止。取PCR产物1μl，2.5%琼脂糖凝胶电泳，采用上海山富科学仪器有限公司的BioSens SC 810B凝胶成像系统拍照后观察记数。

1.3 数据处理采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，以（x±s）表示样本的均数， 两样本均数的比较采用t 检验，两独立样本率的比较采用χ2，定义双侧P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

177例样品DRB1* 04和01分型PCR扩增如图1， 2所示，内参基因片段均被扩增。得到分型结果如下：DRB1* 04在RA 组的频率显著高于对照组（P =0.028）； 它们的比值比（OR） （见表1）。HLA-DRB1*01低于对照组， 但两组差别无统计学意义（P=0.621）。（见表2）

3 讨论

类风湿关节炎是一种以慢性、进行性、侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。病因尚不明确，但遗传和环境在发病机制中起着潜在的作用。

人类主要组织相容性抗原（MHC）拥有多态基因位点，继承了表达于MHC基因位点上某一特定基因的人易患RA，这种特定基因被称为与疾病相关的等位基因。对人类而言，位于细胞表面编码MHC基因位点的细胞表面的蛋白被称为人类白细胞抗原（HLA）。迄今为止，研究最深入的、与RA发病相关性最强的是HLAⅡ类分子。HLA基因不但可以将抗原递呈给T细胞，诱导其活化，并且在胸腺中选择释放至外周血中的T细胞。参与RA发病的HLAⅡ类分子对启动T细胞反应有着重要作用，同时它在关节内发挥着更多的局部作用。[2]

HLAⅡ类分子HLA-DRB1等位基因是第一个与RA有关的易感性基因。与RA 易感性相关的HLA-DRB1共享表位（QK/RRAA）序列位于α-螺旋结构的第70-74位氨基酸[3]。HLA-DRB1*0401，HLA-DRB1*0404，HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0405和HLA-DRB1*1402均携带这段序列。在文献中，HLA-DRB1*04等位基因被报道在许多人群中与RA相关。其他与RA有关的等位基因HLA-DRB1*01在法国、拉丁美洲、亚洲和高加索有报道[4-9]。研究发现，在不同类型RA患者中，如在多关节型RF阳性的RA患者中，DRB1*0401和*0404出现的频率最高。

本研究采用SSP（序列特异性引物）多重PCR技术扩增87例RA患者和90例正常对照HLA-DRB1等位基因， 低分结果共2亚型， 其中HLA-DRB1* 04，在RA组的频率显著高于正常对照组（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在两组差别无显著意义（P =0.621）。本次研究发现HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因，与国内学者苏茵[10]、蒋真[11]研究结果相似。

综上所述，HLA-DRB1* 04位点在青海地区藏族类风湿关节炎患者中的分布具有丰富的多态性， HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因。我国幅员辽阔，有必要在中国多个地区、多民族中进一步探索HLA-DRB1多态性与RA发病相关性，并进一步探讨其作用。

参考文献：

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[10] 苏茵，栗占国，贾汝琳等.HLA-DRB1*04亚型的氨基酸序列与类风湿关节炎易感相关性分析[J].中华风湿病学杂志，2004，8（04）：215-218

[11] 蒋真，李向培，钱龙. HLA-DRB1等位基因分型与类风湿关节炎相关性研究.安徽医药，2010，14（11）：1299-1301