小鼠LIGHT胞外段基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

徐莎等

【摘 要】目的：PCR扩增小鼠LIGHT胞外段基因（LIGHTECD），构建含LIGHTECD的原核表达载体，诱导表达重组蛋白，并免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。方法：提取小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中的总mRNA，RT-PCR技术扩增LIGHTECD，克隆至原核表达质粒pGEX-6P-2中，构建重组表达载体pGEX-6P-2-LIGHTECD。重组质粒进行PCR和基因测序鉴定后，转化大肠杆菌XL-1 Blue，IPTG诱导表达。融合蛋白纯化后纯化后免疫新西兰兔，ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗LIGHTECD抗体的效价和特异性。结果：RT-PCR扩增得到525 bp LIGHTECD目的片段；经PCR和测序鉴定，证明构建的重组质粒中插入的片段为LIGHTECD基因，测序结果经BLAST分析，与Genbank上登录序列完全一致；经IPTG诱导，重组质粒表达一相对分子量（Mr）约为45kD的目的蛋白条带。ELISA 检测免疫兔血清效价为1∶20 000。结论：成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因，并表达了相应可溶性蛋白，准备了高效价的兔抗LIGHTECD多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。

【关键词】LIGHT；原核表达；免疫原性；多克隆抗体

LIGHT （lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for herpesvirus entry on T cells）最早是Mauri等[1]在对单纯疱疹病毒入侵活化T细胞的研究中发现的，是肿瘤坏死因子超家族的第14个成员，又名HVEM-L （Herpesvirus entry mdeiator-Ligand）或TNFSF14，是一种非CD28依赖的协同刺激分子。LIGHT是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，多以三聚体形式表达于活化的T细胞、未成熟DC、单核细胞、脾细胞及粒细胞膜上，也可以分泌型形式存在[2]。目前已经证实TNFSF14可以与3 种膜结合型的TNF受体家族成员结合，即TNFRSF14、LTβR （ lymphotoxinβ receptor）和DcR3，启动不同的生物学效应。现有研究已发现，TNFSF14信号通路通过刺激T细胞增殖、分化和诱导靶细胞凋亡，在抗肿瘤免疫、诱导自身免疫病和移植排斥反应、调节神经触突的发育和脂代谢及抗感染免疫中发挥重要功能[3-9]。

LIGHT作为一个多功能多效应分子，具有共刺激和细胞毒等活性，克隆LIGHT基因并获得其重组蛋白对研究该蛋白的生物学功能具有重要作用。而LIGHT胞外段基因（LIGHTECD）是其与相应受体结合，从而发挥作用的关键部位，因此本实验拟克隆LIGHTECD，构建原核表达载体，表达可溶性蛋白，并制备多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、质粒及主要试剂

4～6w雄性C57BL/6小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。E.coli XL-1 Blue及原核表达质粒pGEX-6p-2均由本研究所保存。rmIL-4（cat#404- ML）、rmGM-CSF（cat#415- ML） 购自R&D公司。DNA胶回收纯化试剂盒、小量质粒提取试剂盒、限制性内切酶（BamHⅠ，NotⅠ）均购自TaKaRa公司。细胞总mRNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司

1.2 树突状细胞总mRNA的提取及cDNA的合成

收集小鼠骨髓来源的树突状细胞，体外用rmIL-4和rmGM-CSF刺激，诱导分化为未成熟树突状细胞。离心收集细胞，用细胞总mRNA提取试剂盒按说明书操作提取细胞总mRNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度后保存。按RT-PCR试剂盒介绍的方法反转录成cDNA。

1.3 小鼠LIGHT胞外段基因的扩增

根据Pubmed数据库小鼠LIGHT基因序列，对照pGEX-6p-2载体上的多克隆酶切位点，设计LIGHTECD的特异性扩增引物。上游引物为：5′-CGG▼GATCCATAGTAGCTCATCTGCCAGA-3′，下划线序列为BamHⅠ酶切位点，下游引物为：5′-ATAAGAATGC▼GGCCGCTCAGACCATGAAAGCTCCG-3′，下划线序列为NotⅠ酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增LIGHTECD。扩增条件为：预变性94℃ 3min后，进入变性94℃ 30s ，退火58℃ 30s，延伸72℃ 45s的循环，共计35次，末次循环后补延72℃ 10min，终止反应。经电泳鉴定后，用DNA胶回收纯化试剂盒纯化PCR产物。

1.4 小鼠LIGHT胞外段基因的克隆及鉴定

纯化的LIGHTECD PCR扩增产物和pGEX-6p-2空质粒经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后，用T4 DNA Ligase 连接，转化至E.coli XL-1 Blue感受态细胞中，用含氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜，筛选阳性克隆并用PCR初步鉴定。挑取PCR初筛阳性的单个菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，提取质粒送往北京赛诺基因组研究中心测序，序列正确的重组质粒命名为pGEX-6p-2-LIGHTECD。

1.5 小鼠LIGHT蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

挑取经测序鉴定的阳性菌落到LB液体培养基（含有100 μg/ml 氨苄青霉素）中，37℃ 培养16～18h。按1∶100比例接种于400 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB 培养基中后，37℃ 培养至A600 nm达0.8。加入IPTG（终浓度为200 μmol/L），22℃ 振荡培养5 h，同时设不加IPTG组作为对照。6000 r/min 离心收集细菌，将细菌沉淀重悬于20 ml 含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，超声。4℃，15000 r/min 离心15 min，收集上清，分装，保存于-80 ℃备用。取1 ml上清液，加20 μl PBS 洗涤过的谷胱苷肽琼脂糖珠4B，室温旋转孵育1 h，离心收集谷胱苷肽琼脂糖珠， 用0.25% PBST洗涤2次，再用PBS洗涤1次后，得到纯化的融合蛋白。经12% SDS-PAGE 凝胶电泳，Coomassie blue染色，鉴定融合蛋白的表达情况。

1.6 动物免疫

取100μL 融合蛋白，加入等体积弗氏完全佐剂，超声充分乳化后，皮下多点注射免疫新西兰大白兔。第一次免疫2w后，取100μL融合蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂超声乳化进行后，免疫第2次，间隔2w进行免疫第3次。同时设PBS免疫组为对照。免疫前及末次免疫后7d，心脏采血，分离兔血清，-20℃保存备用。

1.7 抗体效价测定

用间接ELISA法测定兔免疫血清中特异性抗体效价。用10μg/mL LIGHTECD抗原包被酶标板，每孔100μl，同时设GST蛋白和空白对照。4℃包被过夜，0.05%PBST 洗涤3 次后，用10%BSA 室温封闭1 h，加入倍比稀释的待测兔免疫血清，37℃温育1 h，用0.05%PBST 洗涤3 次，分别加入HRP 标记的羊抗兔IgG，37℃温育1 h，充分洗涤后，加入显色剂ABTS，37℃避光温育5～10min，用2mol/L H2SO4 终止反应，用酶标仪读取405 nm波长处OD值。实验组OD405 大于或等于GST 对照孔2倍以上判为阳性，以阳性者的血清最高稀释度定义为抗体效价，即抗体滴度。

1.8 融合蛋白免疫反应性鉴定

将纯化的LIGHTECD融合蛋白进行SDS- PAGE 电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉封闭后，以免疫兔血清为一抗，HRP 标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot 分析，鉴定LIGHTECD融合蛋白的免疫反应性。

2 结果

2.1 LIGHTECD的PCR扩增

提取小鼠骨髓来源的树突状细胞总mRNA，经RT-PCR扩增后，1.2%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增得到525 bp大小的目的DNA片段，大小与预期结果相符（图1）。

2.2 重组质粒的构建及鉴定

重组质粒pGEX-6p-2-LIGHTECD用LIGHTECD特异性引物扩增得到525bp的目的片段，经序列测定，Blast软件分析测序结果结果表明扩增的目的基因序列与GenBank上登录号为GI：133892635的基因同源性为100%，且密码子读码框架正确。

2.3 LIGHTECD的表达分析

将经测序鉴定的阳性重组质粒转化至E.coli XL-1 Blue表达菌中，IPTG诱导表达后，提取菌体总蛋白，并经谷胱甘肽琼脂糖珠4B纯化后，进行SDS-PAGE分析。结果显示，约在45kD处出现一特异性蛋白条带，与预期目的蛋白大小一致，表明LIGHTECD在原核系统内得到表达（图3）。

2.4 LIGHTECD融合蛋白免疫原性鉴定

用间接ELISA 法测定兔免疫血清中抗LIGHTECD特异性抗体产生水平。结果显示：最高抗体滴度达1∶20 000，而PBS免疫对照组小鼠血清抗体未检测出特异性的抗体，提示LIGHTECD融合蛋白可刺激新西兰大白兔产生免疫反应，该蛋白具有很好的免疫原性。

2.5 LIGHTECD蛋白免疫反应性鉴定

用LIGHTECD兔免疫血清作一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western-blot分析。结果显示：纯化的LIGHTECD重组蛋白在约45kDa 处出现阳性反应带，而只表达GST的空质粒转化表达纯化产物未出现条带，表明兔免疫血清能特异性识别LIGHTECD融合蛋白（图3），该蛋白具有良好的免疫反应性。

3 讨论

LIGHT是新发现的肿瘤坏死因子超家族的第14个成员，主要表达在激活的T淋巴细胞和未成熟DC（iDC）上，并具有刺激T淋巴细胞增殖，诱导iDC成熟，促进Thl型细胞因子产生的功能。ILGHT在不同组织和细胞中的选择性表达，与其在免疫反应中的不同调节作用有关，通过与不同靶细胞上表达的受体结合，LIGHT可启动不同的生物学效应。

本研究分离小鼠骨髓来源的树突状细胞，在其中加入IL-4和GM-CSF，诱导其分化为未成熟DC，以高表达LIGHT。GM-CSF可以诱导DC前体增殖分化，并在体外维持DC的活性，是维持DCs发育及分化最根本的细胞因子；IL-4则能抑制培养物中粒细胞和巨噬细胞的分化增殖，有利于DC分化并维持DCs于未成熟状态。因此，实验过程中常用IL-4和GM-CSF诱导分化未成熟DC。

LIGHT胞外段基因长525bp，编码175个氨基酸。本文从小鼠树突状细胞上成功扩增得到LIGHT胞外段基因片段，与原核表达载体pGEX-6p-2连接，构建了pGEX-6p-2-LIGHTECD原核表达系统。将pGEX-6p-2-LIGHTECD重组质粒转化到E.coli XL1 Blue，经IPTG诱导后表达出可溶性LIGHTECD融合蛋白。

使外源基因在原核细胞中高效表达的前提是选择高效的表达载体和合适的工程。本研究选择的pGEX-6p-2表达载体，是经pBR322质粒改造而来的一种原核表达载体，采用tac启动子，tac启动子是一种由lac启动子（乳糖操纵子）和trp启动子（色氨酸操纵子）人工构建的杂合启动子，它是一种非常强的启动子，可使mRNA转录水平提高，诱导外源基因在宿主菌中高效表达；而且它是一种诱导型启动子，诱导型表达载体在没有诱导物的情况下，外源基因不表达，宿主菌的生长不受目的蛋白的影响，当宿主菌生长到一定量时，加入诱导物IPTG，启动目的蛋白的表达，由此可以获得较高产量的目的蛋白。它含有GST的编码序列，可使表达的外源重组蛋白融合入一个相对分子质量约为26 kD 的 GST纯化标签，该标签对表达蛋白的有效纯化和保持蛋白质的天然生物学活性作用重大。

除了所选择的表达系统和表达菌种可影响目的蛋白的表达及其表达量外，诱导剂的浓度、诱导温度和时间等也均可在一定程度上影响目的蛋白的表达。本文对重组蛋白的诱导表达条件进行了系列探索，结果显示：诱导剂IPTG浓度为200μmol/L、在22℃诱导5h时蛋白表达量较高，并以可溶性形式表达。张亚丽[10]等也构建了LIGHT胞外段的原核表达载体，他们选择的是pET-24a原核表达系统，表达的蛋白主要以包涵体形式存在。本文构建的pGEX-6p-2-LIGTHECD明显优于其构建的pET-24a-LIGTHECD原核表达重组体，利于目的蛋白的纯化及功能研究。

用该重组蛋白免疫新西兰兔制备免疫血清，ELISA测定特异性抗体滴度达1∶20 000，说明该蛋白具有较强的免疫原性。Western Blot 结果显示该原核表达的融合蛋白能与相应的抗体特异性结合。

本研究成功构建了重组质粒pGEX-6p-2-LIGHTECD，并得到相应的可溶性蛋白和兔免疫血清，为下一步的功能研究奠定了基础。

参考文献：

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[10] 张亚丽，江文正，樊燕，等. 小鼠LIGHT胞外段基因原核表达质粒的构建及表达[J]. 免疫学杂志. 2008； 24（4）：389-391，399.