铜伴侣蛋白COX17在胃癌组织中的表达

孙伟等

【摘 要】目的：探讨线粒体铜伴侣蛋白COX17在胃癌发中的表达。方法：利用Real-Time PCR法以及Western blot法检测胃癌中线粒体铜伴侣蛋白基因COX17基因的表达水平。结果：COX17的mRNA及蛋白表达水平在胃癌组织中均表现为低表达（15/20，75%），差异具有显著性（P<0.001）。结论 铜伴侣蛋白COX17在胃癌中异常表达，可能与胃癌发生有关。

【关键词】COX17；胃癌；表达

【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】

COX17是一种分子量约为8kDa的线粒体铜伴侣蛋白，其蛋白异常表达量与活性氧自由基形成有关，可能继发导致基因变异导致肿瘤的发生。因此有必要阐明COX17在胃癌中的表达，初步探讨COX17在肿瘤形成中的可能角色。

1 材料与方法

1.1 材料

20例胃肿瘤组织标本来自青海大学附属医院于2005年5月至10月收治的胃肿瘤患者（男13例），年龄51～87岁。所有标本均由胃癌组织及相距5 cm以上的癌旁正常组织配对组成，标本置液氮，-80℃冻存备用。

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR法（Quantity Real-Time PCR）

利用iCycler iQTM Real-Time PCR反应系统 （Bio-Rad，USA），以cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。引物序列：COX17：上游5′- ATT TGG CTG TCT CCG CTC AT-3′，下游5′- TGT GGG CCT CAA TTA GAT GTC-3′，扩增长度197 bp；β-actin：上游5′-TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC- 3′，下游5′-ACC TTC ACC GTT CCA GTT T-3′，扩增长度150 bp。每个样本设立3个平行反应管，相同样本间扩增CT值小于0.5，取平均值后用于定量计算及分析。PCR参数：94 ℃变性5 min；进入循环后94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环44圈；72 ℃充分延伸5 min。PCR反应结束后从55 ℃到95 ℃按每级0.5 ℃递增作出溶解曲线。

1.2.3 免疫组织化学

免疫组织化学方法：石蜡切片经80℃烤片2小时，二甲苯脱蜡30分钟两次，梯度酒精100%、95%、90%、85%、80%依次水化5分钟；切片放入EDTA（PH8.0）抗原修复高压抗原修复150秒，冷却至室温后1PBS洗片3次，每次5分钟，加入3℅过氧化氢溶液10分钟以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，1PBS浸泡5分钟；5%脱脂奶粉室温封闭1小时，倾去多余封闭液，滴加抗COX17一抗 （Santa Cruz，USA）， 1：500稀释，4℃冰箱过夜；1PBS洗片3次，每次5分钟。滴加二抗，室温1小时；1PBS洗片3次，每次5分钟。用新鲜配置的DAB显色液（Dako， UK）显色10分钟，流水充分冲洗。苏木素复染10秒，自来水冲洗，1%盐水酒精去浮色2秒，温水返兰。梯度酒精回水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.3 统计学处理方法

定量PCR结果利用ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，计算癌组织中基因表达相对于癌旁正常组织变化倍数后取2的对数，大于0的样本为高表达，小于0的样本为低表达。癌与癌旁表达差异用t检验及百分比同时进行统计分析。

2 结果

2.1 胃癌和癌旁正常组织中COX17 mRNA的差异表达

对20对胃癌和癌旁正常组织提取RNA并逆转为cDNA进行Realtime-PCR实验，根据统计得到的实验结果作图（图1）。我们发现有15对（15/20，75%）胃癌组织中的COX17基因 mRNA 表达水平低于与其配对的癌旁正常组织，胃癌与癌旁正常组织COX17 mRNA表达差异具有显著性（表1. p<0.001）。

2.2 胃癌和癌旁正常组织中COX17 蛋白的差异表达

20对胃癌和癌旁正常组织石蜡包埋，制作组织切片进行IHC分析，结果发现胃癌组织及癌旁组织COX17蛋白的表达水平不一致，有16对（16/20，80%）肿瘤组织的COX17蛋白表达水平低于癌旁正常组织（图2），癌与癌旁组织COX17 蛋白表达差异具有显著性（表2. p<0.001）。

3 结论

在我们的研究中发现了胃癌组织中COX17表达下降，表明COX17表达下调与活性氧自由基形成有关[1-2]。因此，推测COX17可能从两方面介入胃癌的发生发展。一方面，COX17的表达改变可以通过活性氧自由基增加正常细胞突变几率并为肿瘤细胞提供选择压力，利于肿瘤细胞形成。另一方面，COX17基因表达下调能减少细胞色素C氧化酶的组装，减少氧气的消耗，更好地适应肿瘤组织中低氧环境，更有利于肿瘤的生长。因此，COX17表达下调在胃癌的形成及发展中可能具有重要的意义。

参考文献：

[1] Kim BE， Nevitt T， Thiele DJ： Mechanisms for copper acquisition， distribution and regulation.Nat Chem Biol，2008，4：176-85，

[2] Cobine PA， Pierrel F， Winge DR： Copper trafficking to the mitochondrion and assembly of copper metalloenzymes. Biochim Biophys Acta， 2006，1763：759-72.