基于Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料固定化酶的葡萄糖生物传感器*

马莉萍，左显维，王艳凤，李云霞，张 彪，韩根亮

(甘肃省科学院传感技术研究所，兰州730000)

葡萄糖生物传感器在临床检验、发酵控制及食品分析等方面发挥着重要的作用，目前绝大多数葡萄糖生物传感器均采用在电极表面修饰葡萄糖氧化酶(GOD)的方法来制备。但是，GOD的氧化还原活性中心位于分子中心，使酶与电极间电子传递很难实现。近年来，将纳米材料引入生物传感器以提高生物酶与基体电极之间的电子传导能力成为研究热点，众多的纳米材料如:Au［1－2］、Ag［3］、Pt［4］等贵重金属以及碳纳米管［5］、导电聚合物薄膜［6］等均已被成功地用于固定生物酶。最近又有研究发现新型的稀土元素纳米氧化物CeO2有助于电子在电极表面的传递［7－8］，从而使其成为在生物传感器领域极具应用前景的一类材料。

一些研究表明，采用纳米材料复合物［9－11］固定生物酶时，组成复合物的各种单元组分在纳米尺度上复合，能产生较强的协同效应，同时又具有纳米粒子的特性。其中，无机纳米材料与有机高分子材料形成的复合物由于集纳米粒子与功能性高分子的特性于一身，在生物传感器中极具应用前景。在众多有机高分子材料中，聚苯胺因合成条件简单，具有优良的导电性，已成为研究热点［12－14］。将导电聚苯胺与无机纳米材料复合，所形成的复合材料不仅具有优良的电化学性能，而且可以使导电聚苯胺在中性环境下有效的进行氧化还原反应，拓展其在生物传感器领域的应用［15－17］。

故本文合成了基于金纳米粒子、氧化铈纳米颗粒和导电聚苯胺的纳米复合材料(Au NPs-CeO2@PANI)，以其固定GOD，实现对葡萄糖浓度的测定。研究表明，本文合成的Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料同时兼具了三种单一材料各自的优点，该纳米材料实现了酶与电极间的直接电子转移，有效地提高了传感器的电流响应、灵敏度和使用寿命，在葡萄糖电化学生物传感器中具有较好的应用前景。

1 实验部分

1.1 试剂

苯胺(An):分析纯(使用前减压蒸馏);硝酸铈(Ce(NO3)3·6H2O)，氯金酸(HAuC14)，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O)，过硫酸铵 ((NH4)2S2O8，APS)，盐酸(HCl)，硝酸(HNO3)，乙醇(C2H6O)均为化学纯;以上试剂均购于上海化学试剂厂。葡萄糖氧化酶(GOD)，壳聚糖(Chit，脱乙酰度85%)，均购于美国Sigma公司。

1.2 仪器

复合材料表征:JEM－100SX型电子透射显微镜(日本电子公司);D/MAX－3C型X射线衍射仪(日本Rigaku公司);FTS3000FX型的傅立叶变换红外光谱仪(美国DIGILAB公司)，KBr压片;PE-PYRIS Diamond TG/DTA热重分析仪。

电化学实验:AUTOLAB PGSTAT 128N模块式电化学综合测试系统(瑞士万通公司)，电化学测量采用三电极体系:酶电极为工作电极，铂片电极作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极。所有电化学实验均在室温下进行。

1.3 Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料的合成

参照已报道的文献［18－19］，首先制备出氧化铈纳米颗粒和金溶胶。然后，按以下步骤合成Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料:①将一定量的CeO2纳米颗粒超声分散在20 mL 1 mol/L HCl溶液中，再加入1 mL苯胺单体，超声分散30 min，形成悬浮液 A;②将2.49 g(NH4)2S2O8溶解在 5 mL 1 mol/L盐酸溶液中，形成溶液B。③用滴液漏斗将B缓慢滴加到A中，在磁力搅拌下反应12 h。反应结束后离心分离，分别用0.1 mol/L盐酸溶液、乙醇和二次水洗涤产物至离心液为无色，60℃真空干燥24 h，得到CeO2@PANI纳米复合材料。④将经①②③步所得的具有核－壳结构的CeO2@PANI纳米复合材料在浓度为1.0 mg/mL金溶胶中搅拌12 h后，离心分离，并将产物真空干燥，既得Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料。

采用上述类似方法制备了掺杂态PANI、CeO2@PANI纳米复合材料及Au NPs-PANI纳米复合材料。

1.4 Chit/Au NPs-CeO2@PANI/GOD 修饰电极的制备

直径为2 mm的铂盘电极用0.3及0.5 μm的Al2O3抛光粉打磨，依次用去离子水、无水乙醇及丙酮超声清洗3 min。然后在0.5%H2SO4中进行电化学预处理，以增加电极表面电活性点的浓度，将电极在－0.4 V～+1.0 V下以50 mV/s扫速循环伏安扫描30圈至稳定。

将制备好的Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料在去离子水中超声分散2 h，使溶液浓度为1.0 mg/mL;取 Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料、1 mg/μL葡萄糖氧化酶及质量分数为1.0%壳聚糖，按体积比为3∶3∶1充分混匀后滴于电极表面，4℃放置晾干，作为工作电极。对照组各修饰电极的制备同上。

1.5 测量方法

电化学测量采用三电极系统:铂盘电极(直径3 mm)为工作电极，饱和甘汞(SEC)电极为参比电极，铂片为对电极;以0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)为支持电解质，室温条件下，加入不同浓度葡萄糖，在0.8 V～0.2 V范围内进行循环伏安扫描，记录循环伏安扫描曲线。电流时间曲线测定时，工作电位为－0.55 V(vs.SCE)，搅拌时测定。测试时体系通N2除O2。

2 结果与讨论

2.1Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料的结构表征

图1(a)为Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料的透射电镜(TEM)图，从图中可看出颜色较深的无机物CeO2纳米颗粒被完全包埋在颜色较浅的无定形的有机物聚苯胺中，形成了核－壳结构;壳层聚苯胺的厚度大约有25 nm，而被包埋的CeO2核平均粒径在10 nm左右。TEM图中像蓖麻一样的小黑点为金纳米颗粒，这些金纳米颗粒均被牢牢地吸附在聚苯胺的表面。在图中没有观察到有机相与无机相两相的分离现象，这说明无机物CeO2、Au与有机物 PANI之间很好的复合在了一起。

图1 Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料的TEM图(a)和XRD谱图(b)

图1(b)为Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料X射线衍射谱(XRD)，在 2θ=15.48°、20.30°和 25.10°处出现了宽的衍射峰为结晶态聚苯胺的特征衍射峰［14］;在 2θ=28.4°，32.3°，46.7°，55.9°，58.1°和67.5°处出现的衍射峰与立方晶系CeO2的标准谱图(JCPDS卡号 No.34－0394)一致;而另外在 2θ=37.1°，44.2°，63.4°，和 77.8°的四处衍射峰与立方晶系Au的标准谱图(JCPDS卡号No.01－1172)一致，这表明该样品是由聚苯胺、CeO2和组成Au的。根据Scherrer公式 D=k(/βcosθ(k 取 0.89，(为 0.154 nm)，由2θ=28.4°处半峰宽计算出样品中 CeO2粒子的粒径为10.5 nm，这与TEM结果基本一致。

2.2 修饰电极的电化学特性

图2为不同修饰电极在0.2 mol/L PBS(pH=7.0)中的循环伏安扫描图扫速为50 mV/s。由图中可看出，GOD修饰的电极没有氧化还原峰(图2(a))，表明酶与电极间的电子转移无法实现;Chit/CeO2-PANI/GOD及Chit/Au-PANI/GOD修饰的电极氧化还原峰不明显(图2(b)、(c))，表明这些材料修饰的电极表面酶与电极间的电子转移较难实现;而Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极出现了较为对称的氧化还原峰(图2(d))，峰电势分别为在0.55和0.03，说明该修饰电极使酶与电极间的电子转移容易实现，并且葡萄糖氧化酶在电极上保持了良好的生物活性。

Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料在中性条件下有良好的氧化还原活性，且有效的实现了酶与电极之间的直接电子转移，主要是因为:①CeO2具有较高的等电点(IEP)(9.0)，它适合吸附具有低IEP(4.2)的GOD，对带负电性的GOD提供友好的微环境，能在很大程度上促进GOD和电极之间的电子传递;②PANI能很好的催化GOD，同时，纳米结构的PANI负载酶时，其巨大的比表面积增加了载酶量;③纳米Au的优良导电性能。本文合成的Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料同时兼具了三种单一材料各自的优点，而且复合材料比单一纳米颗粒更易于形成连续势场，可降低电子在电极和固定化酶间的迁移阻力，能有效加速GOD的再生过程，显著增强了传感器的电流响应。

图2 不同修饰电极在0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中的循环伏安扫描图，扫速为50 mV/s

图3为Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极在10 mmol/L葡萄糖溶液中不同扫速下的循环伏安图，从图中可看到，随着扫速从10 mV/s增加到100 mV/s，GOD氧化还原峰电流随扫描速率的增加而增大，这是因为随着扫描速度加快，单位时间通过电极表面的电子增多使电流变大;而图3中峰电势差为0.52 V，峰电势差不随扫速的变化而变化，表明电极反应是准可逆过程。插图为峰电流与扫速的平方根的关系图，经计算阳极和阴极的峰电流Ip与扫描速率的平方根成线性关系(见图3插图)，表明修饰电极上的电化学反应主要是受扩散控制。此外，在连续的扫描过程中C－V图基本保持不变，说明GOD的活性在Chit/Au-CeO2-PANI复合膜中是稳定的。

图3 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极在不同扫速下的循环伏安图(插图：峰电流与扫速的平方根的关系图)

2.3 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极对葡萄糖催化的电化学行为

图4是Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极在PBS(pH=7.0)溶液中及1 mmol/L葡萄糖溶液中的循环伏安曲线比较图。由图可知，当加入葡萄糖之后(图4b)，氧化峰电流明显增大，显示了明显的GOD对葡萄糖的催化氧化能力。

图4 修饰电极的CV图

2.4 电流时间曲线及线性检测

图5为在0.55 V电位下 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极对葡萄糖的电流响应随葡萄糖浓度变化的计时安培动力学曲线。由图可见，氧化峰电流随着葡萄糖浓度的增加呈台阶式上升，电极电流响应时间为5 s，表明Chit/Au-CeO2-PANI复合膜吸附固定的GOD对葡萄糖具有优良的催化氧化能力，可在电极表面迅速建立氧化还原平衡反应。在6.2×10－6mol/L ～2.8×10－3mol/L 范围内，电极电流响应与葡萄糖浓度呈线性关系(图5插图)，检测下限为1.0×10－6mol/L，线性方程:I(μA)=0.118+5.065 C(mmol/L)，相关系数为0.996 8。随着葡萄糖浓度的进一步增加，电流到达平台期，遵从Michaelis-Menten kinetics动力学方程的特性。

图5 传感器对葡萄糖响应的电流－时间曲线(插图：电极电流响应与葡萄糖浓度的线性关系图)

相同条件下，Au修饰电极检测葡萄糖线性线性范围为 4.0×10－5mol/L ～1.0×10－3mol/L，响应时间10 s;CeO2-PANI修饰电极检测葡萄糖线性线性范围为 9.0×10－4mol/L ～ 1.0×10－2mol/L，响应时间15 s，Au-PANI检测葡萄糖线性线性范围为1.0×10－5mol/L ～ 1.0×10－3mol/L，响应时间 8 s。说明Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料修饰的电极显示出了比单一或二者复合的纳米材料修饰电极更优越的性能。

2.5 传感器的稳定性检测

图6为Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修饰电极的稳定性检测。电极不用时保存于4℃。该电极在保存5天后，酶活下降约4%，三周后，电极对葡萄糖的响应仍能保持原来的80%(如图6所示)，可见该传感器有较好的稳定性。表明Chit/Au-CeO2-PANI复合膜能很好地固定GOD，使用纳米材料能最大限度的保持酶的活力。

图6 传感器的稳定性检测

3 结论

本文首先成功合成了Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料，对其进行了表征。然后，将该纳米复合材料应用于葡萄糖生物传感器中，并对传感器进行了电化学性能测试。研究结果表明，该Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料修饰的电极比单一或任意二者复合材料修饰电极具有更好的电催化活性，显示了优越的性能，如:高灵敏度、低检测限、高稳定性等，提高了电极与生物酶之间的电子转移。该生物传感器检测葡萄糖的线性范围为 6.2×10－6mol/L ～ 2.8×10－3mol/L，响应时间为5 s，检测下限为1.0×10－6mol/L。

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