声表面波串联谐振器传感系统构建及初步应用研究*

姜 燕，沈 凤，尹芳缘，陈裕泉，惠国华*

(1.浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州310035;2浙江大学生物医学工程与仪器科学学院，杭州310027)

近年来，检测细胞化学灵敏性和生物活性的检测技术成为研究的焦点。现有检测方法，诸如荧光成像法、放射性分析等，不但对实验室检测环境有严格的要求，而且所需仪器设备、试剂成本较高［1-2］。此外，这些技术在连续检测方面存在一定的不足，难以实现特定时间内细胞活动情况的及时跟踪的目标。细胞传感器吸引了许多研究人员的注意力，该技术使用活细胞作为敏感元件，通过物质与细胞间的生化反应来实现检测物信息的标定［3-6］。电化学阻抗谱传感器是细胞传感器研究中的典型应用，在细胞贴附和活动检测、药物分析、毒理评估等领域有广泛应用［7-14］。刘清君等以微电极阵列(MEA)的阻抗分析，实现了KYSE 30细胞的贴附、散布、增殖等形态学变化。并采用抗癌药物Cisplatin作用于细胞，实验结果表明该方法为癌症研究提供了一种新技术［15］。微电极阵列的制备成本较高，Ding等人研究了一种基于丝网印刷电极的K562 Leukaemia细胞贴附和增殖电阻抗谱检测方法［16］。丝网印刷电极成本低，在实验中一次性使用，可有效的降低检测成本。但是电化学阻抗谱分析仪器往往具有体积较大、价格昂贵等特点，难以满足现场快速检测的需要。

声表面波(SAW)技术诞生于20世纪70年代，该方法为制作尺寸小、高灵敏度、高集成度的检测设备提供了基础［17-21］。目前已有许多基于声表面波器件的检测应用报道［22-24］，如牛奶中细菌的检测［25］，细菌生长情况监测［26］，血浆中盐分分析［27-28］，有机农药检测［29］，尿液分析［30］，液相金属离子检测［31］，湿度检测［32］等领域。

基于以上分析，我们提出一种用于细胞浓度检测的高频串联声表面波谐振器传感系统，将小鼠肠道内分泌肿瘤细胞STC-1悬液滴凃于丝网印刷碳电极之上，将丝网印刷电极与433 MHz的声表面波谐振器串联。使用频率计记录检测数据并通过RS-232通讯口传输至电脑。实验结果表明构建的检测系统实现了STC-1细胞悬液浓度检测。

1 检测系统及实验

1.1 实验试剂

DMEM高糖培养液(1×)(吉诺生物医药技术有限公司);FBS(Fetal Bovine Serum)(吉诺);L-谷氨酰胺溶液(200 mmol/L，100×)(吉诺);PBS(1×)(吉诺);无水乙醇(AR)(成都市科龙化工试剂厂);75%酒精溶液;无菌水;0.25%胰酶溶液(1×)(吉诺);4%多聚甲醛(PFA);Triton X-100(Washington);2%BSA;缓冲甘油;25%戊二醛溶液(上海化工试剂采购供应五联化工厂)。

1.2 实验仪器

数显鼓风干燥箱(GZX-9070，MBE);超净工作台(苏州净化仪器有限公司);CO2培养箱(SHEL，LAB);冰箱(BCD-196F，青岛海尔股份有限公司);倒置生物显微镜(XD-101);实体显微镜(Leica，MZ16A);CCD数码摄像头(Leica，DFC490);激光共聚焦显微镜(Leica，SP2);电子分析天平(PB 203-N，Mettler Toledo);微处理 pH 计(pH211，HANNA Instruments);低速离心机(Anke，TDL-60B);IB-5型离子溅射仪;XL30型环境扫描电镜(荷兰Philips公司);数显恒温水浴锅(上海锦屏仪器仪表有限公司)。

1.3 STC-1细胞悬液制备

实验采用小鼠肠道内分泌细胞系STC-1细胞。细胞培养液采用向DMEM高糖培养基中加入10%FBS、2%谷氨酰胺和1%双抗，再用0.22 μm的滤膜过滤除菌，最后分装备用。采用显微镜观察原始STC-1细胞悬液浓度为1×106cell/mL，采用细胞培养液将原始细胞悬液稀释为 5×105cell/mL，2.5×105cell/mL，1.25×105cell/mL，1×105cell/mL。取每种浓度细胞悬液100 μL滴凃于丝网印刷电极表面用于实验。

1.4 声表面波检测系统构成

图1(a)为检测系统结构示意图，主要包括丝网印刷碳电极(ASTech 125，亚泰博科技术股份有限公司)、声表面波谐振器及负载电路、稳压电源(DF1741SB3A，宁波中策电子股份有限公司)、通用计数器(EE3386，江苏新电联科技股份有限公司)。声表面波谐振器及负载电路由本实验室自主开发，选用ST切型石英作为压电基底材料，采用精密光刻工艺制备频率为433 MHz的高频单端声表面波谐振器，如图1(b)和1(c)所示。

图1 检测系统结构示意图

声表面波谐振器负载丝网印刷电极的等效电路如图2所示，C0为静态电容，Ls、Cs与Rs分别为声表面波谐振器的动态电感、动态电容与动态电阻。当丝网印刷碳电极与谐振器串联之后，Ce与Re分别是丝网印刷碳电极的等效电容与等效电阻。声表面波谐振器负载丝网印刷电极的频率计算为:

图2 声表面波谐振器负载丝网印刷电极等效模型

2 实验结果

各个细胞悬液的声表面波串联谐振频率响应如图3所示，该传感器对不同浓度的细胞悬液有灵敏的响应。图3(a)为无细胞的空白电极的频率响应，空白频率稳定在312.25 MHz。声表面波谐振器频率为433 MHz，由于串联入丝网印刷电极等因素引起频率下降，重新装312.25 MHz建立新的平衡点。图3(b)为扣除空白后的1×105cell/mL悬液的频率曲线，频率大致在1 281.6 MHz附近波动。同样的，1.25×105cell/mL、2.5×105cell/mL、5.0×105cell/mL、1.0×105cell/mL的声表面波谐振频率分别1 292.2 MHz、1 295.2 MHz、1 296.4 MHz、1 308.5 MHz附近波动，在随着细胞悬液浓度的上升，声表面波串联谐振器的频率上升。细胞悬液和声表面波谐振频率关系如图4所示。

图3 STC-1细胞悬液浓度检测结果

图4 STC-1细胞悬液浓度检测模型

根据图4，我们可以得到声表面波谐振器频率与细胞悬液浓度间线性拟合回归关系为:

其中Frequency代表声表面波谐振器频率，Cellcon代表STC-1细胞悬液浓度。因此，一定范围内的细胞悬液浓度可以通过式(2)进行预测:

基于以上分析，声表面波串联谐振器传感系统检测频率与细胞悬液浓度之间有着一定的对应关系，这为开发出一种新型的微型化细胞传感技术提供了技术可行性，如新型抗癌药物对癌细胞的靶向药理作用、味觉受体细胞对味质分子刺激的特异性响应等。

3 结语

本文探索了一种基于串联声表面波谐振器的细胞悬液浓度分析方法。将丝网印刷碳电极与真空封装的433 MHz声表面波谐振器串联作为检测元件。将不同浓度的STC-1细胞悬液滴凃在丝网印刷碳电极表面用于实验。由于电极表面有不同浓度的细胞存在，因此丝网印刷电极的极间电阻等参数产生了相应的变化，最终影响到声表面波谐振器的输出频率。实验结果验证细胞悬液浓度与输出频率之间具有一定的线性关系。相比较与电化学阻抗谱等研究方法，本研究为细胞传感器的小型化提供了研究基础。同时，丝网印刷碳电极具有生物相容性好、成本低、一次即抛、可工业化批量生产等优势，这也是本研究的一个显著特色。我们将开展一项长期的计划以探索该检测方法在生物传感检测中的应用。

［1］ Liu Y，Peterson D A，Kimura H，et al.Mechanism of Cellular 3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-Diphenyltetrazolium Bromide(MTT)reduction［J］.J Neurochem，1997，69(2):581-593.

［2］ Mosmann T.Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays［J］.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.

［3］ Bousse L.Whole Cell Biosensors［J］.Sens Actuators B:Chem，1996，34(1-3):270-275.

［4］ Pancrazio J J，Whelan J P，Borkholder D A，et al.Development and Application of Cell-Based Biosensors［J］.Ann Biomed Eng，1999，27(6):697-711.

［5］ Wang P，Xu G，Liu Q，et al.Cell-Based Biosensors and Its Application in Biomedicine［J］.Sens Actuators:Chem，2005，108(1-2):576-584.

［6］ Yu J，Jha S K，Xiao L，et al.AlGaN/GaN Heterostructures for Non-Invasive Cell Electrophysiological Measurements［J］.Biosens Bioelectron，2007，23(4):513-519.

［7］ Giaever I，Keese C R.Monitoring Fibroblast Behavior in Tissue Culture with an Applied Electric field［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1984，81(12):3761-3764.

［8］ Giaever I，Keese C R.Use of Electric Fields to Monitor the Dynamical Aspect of Cell Behavior in Tissue Culture［J］.Chemtech，1986，33(2):242-247.

［9］ Giaever I，Keese C R.A Morphological Biosensor for Mammalian Cells［J］.Nature，1993，366(6455):591-592.

［10］ Asphahani F，Zhang M.Cellular Impedance Biosensors for Drug Screening and Toxin Detection［J］.The Analyst，2007，132(9):835-841.

［11］ Yin H Y，Wang F L，Wang A L，et al.Bioelectrical Impedance Assay to Monitor Changes in Aspirin-Treated Human Colon Cancer HT-29 Cell Shape during Apoptosis［J］.Anal Lett，2007，40(1):85-94.

［12］ Ceriotti L，Ponti J，Broggi F，et al.Real-Time Assessment of Cytotoxicity by Impedance Measurement on a 96-Well Plate［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，2007，123(2):769-778.

［13］ Curtis T M，Widder M W，Brennan L M，et al.A Portable Cell-Based Impedance Sensor for Toxicity Testing of Drinkingwater［J］.Lab on a Chip，2009，9(15)2176-2183.

［14］ Kloß D，Fischer M，Rothermel A，et al.Drug Testing on 3D in vitro Tissues Trapped on a Microcavity Chip［J］.Lab on a Chip，2008，8(6)879-884.

［15］ Liu Q J，Yu J J，Xiao L D，et al.Impedance Studies of Bio-Behavior and Chemosensitivity of Cancer Cells by Micro-Electrode Arrays［J］.Biosens Bioelectron，2009，24(5):1305-1310.

［16］ Ding L，Du D，Wu J，et al.A Disposable Impedance Sensor for Electrochemical Study and Monitoring of Adhesion and Proliferation of K562 Leukaemia Cells［J］.Electrochem Commu，2007，9(5):953-958.

［17］ Wohltjen H，Dessy R.Surface Acoustic Wave Probe for Chemical Analysis.Ⅰ.Introduction and Instrument Description［J］.Anal Chem，1979，51:1458-1464.

［18］ Hoyt A E，Ricco A J，Bartholomew J W，et al.SAW Sensors for the Room-Temperature Measurement of CO2and Relative Humidity［J］.Anal Chem，1998，70:2137-2145.

［19］ Caliendo C，Fratoddi I，Russo M V.Sensitivity of a Platinum-Polyyne-Based Sensor to Low Relative Humidity and Chemical Vapors［J］.Appl Phys Lett，2002，80(25):4849-4851.

［20］ Shen C Y，Huang C P，Huang W T.Gas-Detecting Properties of Surface Acoustic Wave Ammonia Sensors［J］.Sens Actuators:Chem，2004，101(1-2):1-7.

［21］ Atashbar M Z，Sadek A Z，Wlodarski W，et al.Layered SAW Gas Sensor Based on CSA Synthesized Polyaniline Nanofiber on AlN on 64°YX LiNbO3for H2Sensing［J］.Sens Actuators:Chem，2009，138(1):85-89.

［22］ Leidl A，Hartinger R，Ruth M，et al.A New SO2Sensor System with SAW and IDC Elements［J］.Sens.Actuators:Chem，1996，34(1-3):339-342.

［23］ Du X S，Ying Z H，Jiang Y D，et al.Synthesis and Evaluation of a New Polysiloxane as SAW Sensor Coating for DMMP Detection［J］.Sens Actuators:Chem，2008，134(2):409-413.

［24］ Mashat L A，Tran H D，Wlodarski W，et al.Polypyrrole Nanofiber Surface Acoustic Wave Gas Sensors［J］.Sens Actuators:Chem，2008，134(2):826-831.

［25］ Gardner J W，Cole M，Dowson C G，et al.Smart Acoustic Sensor for the Detection of Bacteria in Milk［J］.Proc Int Conf Biomed Eng，2005，539-542.

［26］ Chang K S，Chang C K，Chen C Y.A Surface Acoustic Wave Sensor Modified from a Wireless Transmitter for the Monitoring of the Growth of Bacteria［J］.Sens Actuators:Chem，2007，125:207-213.

［27］ Yao S，Chen K，Zhu F，et al.Surface Acoustic Wave Sensor System for the Determination of Total Salt Content in Serum［J］.Anal Chim Acta，1994，287(1-2):65-73.

［28］ Yao S，Chen K，Nie L.Application of a Surface Acoustic Wave Sensor System for the Determination of Non-Aqueous Solutions and Phase Transitions in Lipid Multibilayers［J］.Anal Chim Acta，1994，289(1):47-55.

［29］杨明艳，毛伟，贝伟斌，等.声表面波DDT有机氯农药免疫生物传感器的研究［J］.传感技术学报，2007，20(1):1-4.

［30］ Liu D，Chen K，Ge K，et al.Study on the Urease Activity in Different Plant Seeds and Clinical Analysis of Urea in Human Body Fluids by a Surface Acoustic Wave Enzyme Sensor System［J］.Fresenius J Anal Chem，1996，354(1):114-117.

［31］叶学松，樊海涛，杨明艳，等.声表面波液相金属离子传感器［J］.传感技术学报，2004，17(2):281-284.

［32］雷声，陈大竞，陈裕泉，等.基于MWCNTs/Nafion复合膜的高性能声表面波湿敏传感器研究［J］.传感技术学报，2011，24(6):813-817.