C反应蛋白和生长停滞特异性基因产物6基因交互作用与中国汉族人群缺血性脑卒中及其亚型的关联研究

李晓峰，陈忠云，李 婧，高永俊，赵晓丽，赵 静，杨 旭

卒中是人类致死和致残的世界第二大疾病[1]，其中，75%是缺血性脑卒中(IS)。但传统的危险因素，如高血压、糖尿病、肥胖、吸烟等不能解释所有的卒中事件。研究表明，遗传因素在IS易患性中起着重要作用[2-3]；炎症反应与IS的发生风险、进展及结局亦密切相关[4]。因此，编码炎性分子的基因变异可能影响IS的发生、发展过程，且已有许多关于不同的炎性候选基因与IS的发病机制的研究[5-6]。如C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、生长停滞特异性基因产物6(growth arrest-specific gene 6,GAS6)等[7-9]。但随着研究的深入，学者们发现单个位点的主效应可能仅引起较弱的效应，因此，越来越多的学者们致力于研究不同基因之间的交互作用。在此背景下，本研究采用回顾性病例对照研究，评价促血栓和促动脉粥样硬化的CRP和GAS6基因多态性的独立效应，并进一步采用基于多因素降维法(multifactor dimensionality reduction,MDR)的广义的多因素降维法(generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)对二者之间潜在的基因-基因交互作用进行研究。鉴于不同的卒中亚型有不同的遗传因素，本研究亦对IS亚型进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用回顾性病例对照研究。于2010年10月—2012年12月连续收集入住航天中心医院神经内科的IS患者129例为病例组，其中男86例，女43例；平均年龄(67.0±9.8)岁；均为发病5 d内入选。所有患者于入院48 h内经颅脑CT或MRI证实，并以颈部血管超声、颅脑彩色多普勒(必要时行颅脑CT血管造影或磁共振血管造影等检查)评价脑血管状态，IS诊断符合WHO卒中诊断标准[10]。同时根据TOAST分型[11]，分为大动脉粥样硬化性脑卒中(large-artery atherosclerosis，LAA )91例和小动脉闭塞性脑卒中或腔隙性脑卒中(small-artery occlusion，SAA)38例，同时剔除心源性栓塞、其他原因类型(SOD)及不明原因(SUD)的IS患者。同期从体检中心随机选取非IS者192例为对照组，其中男90例，女102例；平均年龄(67.2±6.2)岁；根据临床分析和实验室评估，除患有高血压、糖尿病和冠心病外，无其他任何身体不适。

1.2 资料收集 测量血压、血糖、血脂、身高、体质量，计算体质指数(BMI)；询问冠心病病史、脑卒中家族史、吸烟史、饮酒史等。高血压定义为收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mm Hg或当前应用降压药物；糖尿病定义为目前服用降糖药物，或空腹血糖≥7.0 mmol/L。冠心病定义为既往有明确的心绞痛、心肌梗死病史。脑卒中家族史定义为至少有1个一级直系亲属曾患脑梗死。吸烟史定义为5年吸烟>10支/d。饮酒史定义为至少每星期饮酒1次，且每次>50 ml，连续半年以上。以BMI≥25 kg/m2为肥胖和(或)超重。如果与患者无法沟通，可通过其直系亲属采集病史资料。本研究协议经当地伦理协会和医院伦理委员会审查批准，所有患者签署知情同意书。

1.3 单核苷酸多态性(SNP)选择及基因型确定 既往研究发现的GAS6 SNP位点中，仅有第8内含子rs8191974:G>A基因型频率有差异，因此本研究选择此位点。同时依据HapMap数据库(http://www.hapmap.org)，并运用Haploview 3.0软件(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)，在HapMap Format中读取CHB数据，设置最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)的最小值为0.01，以SNP之间r2>0.8的原则，选择CRP rs1130864:C>T和rs3093059:T>C、GAS6 rs8191974:G>A和rs7400722:C>T共4个SNP位点。

研究对象于次日清晨采集空腹静脉血2 ml(EDTA抗凝)，用盐析法提取外周白细胞中基因组DNA。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术检测各SNP基因型，所用引物均应用软件Premier 5.0自行设计，上海英俊生物技术有限公司合成。PCR反应结束后，扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析系统观察PCR扩增结果。PCR产物由2 U限制性内切酶(NEB公司) 进行消化，65 ℃温育1 h，反应终产物经含溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。分型后取5%样本量行直接测序验证(见表 1)。

表1 CRP和GAS6 SNP引物序列、限制性内切酶和酶切产物长度

注：F为正向引物，R为反向引物

2 结果

2.1 对照组与病例组一般资料比较 对照组与病例组年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；与对照组比较，病例组男性比例、收缩压、舒张压、空腹血糖、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平及高血压病史、糖尿病病史、冠心病病史、脑卒中家族史、吸烟史、饮酒史比例升高，总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与LAA组、SAA组年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；与对照组比较，LAA组和SAA组男性比例、收缩压、舒张压、空腹血糖、TG、LDL水平及高血压病史、糖尿病病史、冠心病病史、吸烟史比例升高，TC、HDL水平降低，LAA组脑卒中家族史、饮酒史比例升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 对照组与病例组一般资料比较

注：LAA=大动脉粥样硬化性脑卒中，SAA=小动脉闭塞性脑卒中或腔隙性脑卒中，BMI=体质指数，TC=总胆固醇、TG=三酰甘油，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；与对照组比较，*P<0.05；△为χ2值；☆为对照组与病例组比较；★为对照组、LAA组、SAA组比较

2.2 基因型分析 CRP rs3093059:T>C和 rs1130864:C>T、GAS6 rs8191974:G>A和rs7400722:C>T 4个SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡检验，基因频率能够代表群体的基因分布。对照组与病例组，对照组与LAA、SAA组基因型分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表 3)。

表3 不同组间基因型分布比较(例)

注：☆为对照组与病例组比较；★为对照组、LAA组、SAA组比较

2.3 基因-基因交互作用与IS易患性分析 LAA组基因交互作用差异有统计学意义(P<0.05)，CRP rs3093059和GAS6 rs7400722为最佳交互作用模型(检验样本一致性=61.29%；交叉验证一致性=10；P=0.0107，见表4～6)。

表4 对照组与病例组GMDR分析结果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

进一步采用树状图分析二者之间的交互作用。CRP rs3093059与GAS6 rs7400722在相同分支，且相互靠近。而CRP rs1130864与GAS6 rs8191974在不同分支，且距离较远(见图1)。

交互放射图显示CRP rs3093059与GAS6 rs7400722具有明显的交互效应。独立分析显示CRP rs3093059 占1.08%，GAS6 rs7400722占1.04%，两个SNP间的交互作用在交互放射图中占主导地位(1.49%，见图2)。

表5 对照组与LAA组GMDR分析结果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

表6 对照组与SAA组GMDR分析结果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

图1 LAA组的交互树状图

图2 LAA组的交互放射图

2.4 Logistic回归分析 rs3093059 TC+CC和rs7400722 CT+TT具有较高的LAA发生风险(P=0.041)，进一步采用多因素Logistic回归分析，校正高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、冠心病和脑卒中家族史相关危险因素后，结果亦未改变(P=0.039，见表7)。

表7 rs3093059与rs7400722联合作用与LAA的相关性

3 讨论

本研究依据既往研究结果及HapMap数据库，选择中国汉族人群CRP基因rs3093059:T>C和rs1130864:C>T、GAS6基因rs8191974:G>A和rs7400722:C>T 4个SNP位点探讨炎性基因间交互作用与IS及其亚型相关性。单位点分析表明，4个SNP位点与IS及其亚型的发生均无相关性，与既往Kuhlenbaeumer等[8]、Hurtado等[9]的研究结果一致。

MDR是由Ritchie等[12]首次在研究散发性乳腺癌的研究中使用。MDR虽不能分析危险因素的主效应，但能发现高阶的交互作用，尤其适合在发病机制复杂的疾病中探讨基因-基因、基因-环境之间的交互作用，可以更好地解释疾病基因水平的发病机制。本研究采用GMDR分析发现，LAA组rs3093059:T>C与rs7400722:C>T之间存在交互作用。多因素Logistic回归分析表明，隐性模型rs3093059 TC+CC和rs7400722 CT+TT与rs3093059 TT和rs7400722 CC相比，具有较高的发病风险，校正相关危险因素后，结果一样。表明CRP rs3093059 C与GAS6 rs7400722 T二者可能共同促进了LAA的发生。

CRP是一种急性炎症时相反应蛋白，既往研究表明，其可诱导内皮细胞黏附分子的产生[10，13]，促使原型LDL形成泡沫细胞[11，14]，通过受体介导的趋化反应募集单核细胞[15]，并诱导其释放组织因子[16]，进而促进动脉粥样硬化的发生、发展，进而导致IS的发生。rs3093059:T>C位于CRP基因假定的启动子区，其可能在一定程度上调控CRP的表达，影响血清CRP水平。目前关于该位点的相关性研究尚少，国内学者Shen等[17]采用病例对照研究，检测了中国汉族548例IS患者和993例非IS对照人群rs3093059的SNP，结果显示rs3093059加性模型〔OR=0.697，95%CI(0.528，0.921)，P=0.011〕、显性模型〔OR=0.671，95%CI(0.487,0.923)，P=0.044〕及最小等位基因C〔OR=0.811，95%CI(0.666，0.988)，P=0.037〕与IS的发生密切相关，表明等位基因C可作为IS的一个保护因素。Ben Assaya等[18]探讨rs3093059多态性与颈总动脉内膜中层厚度相关性，多因素分析表明，rs3093059等位基因C与冠状动脉造影(CCA)内膜中层厚度(IMT)亦有关〔OR=1.74，95%CI(1.11，2.77)，P=0.002〕。

GAS6是维生素K依赖蛋白家族的一员，可与其受体酪氨酸激酶家族(包括Axl、Sky、 Mer)结合，参与炎症反应[19-20]、血小板聚集[21-22]和动脉粥样硬化[23-24]等IS发病机制的发生。rs7400722:C>T位于内含子区，推测该SNP位点可能引起剪切位点改变，继而影响转录及转录后加工等过程，导致编码GAS6的蛋白质功能异常或活性改变[25]，进而影响血小板活化和动脉粥样硬化的进程，最终促进IS的发生。笔者先前的研究结果显示rs7400722:C>T与IS及其亚型的发生均无相关性[26]。在本研究中，通过GMDR分析，发现该位点与rs3093059:T>C存在交互作用，推测CRP和GAS6二者可能共同参与了动脉粥样硬化的发生、发展，共同导致了IS的发生。

此外，本研究亦存在一定的不足。首先，样本量小，论证强度较低；其次，仅对4个常见的SNP位点进行分析，未对其他与IS相关的候选基因进行研究；最后，所选SNP并不能完全代表整个基因，下一步仍需结合人类HapMap数据库选择多个SNP标签。

综上所述， rs3093059:T>C与rs7400722:C>T之间存在交互作用，隐性模型rs3093059 TC+CC可能协同rs7400722 CT+TT增加了LAA的发生风险，CRP和GAS6基因可能共同影响了IS的易患性。

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