以适体作为载体介导siRNA 靶向运输的研究进展

张诗蒙刘非郑磊王前★

•综 述•

以适体作为载体介导siRNA 靶向运输的研究进展

张诗蒙1刘非2郑磊1王前1★

小干扰RNA（siRNA）通过RNAi途径沉默目的基因，因此其在疾病治疗领域的应用受到关注。如今siRNA作为药物应用于治疗的主要问题是如何将siRNA靶向传递到目标细胞或组织。适体是一种体外合成的单链DNA或RNA寡核苷酸，由于对靶分子有高特异性、穿透力强、低免疫原性等特点，适体可作为载体用于药物的靶向运输。本文主要介绍用适体介导siRNA靶向传递的研究进展。

适体；siRNA；RNA干扰；靶向传递

随着近些年科学技术的发展，基因治疗、个体化医疗等逐渐成为讨论的热点。小干扰RNA（smallinterference RNA，siRNA）通过RNA干扰途径抑制靶基因的表达；而适体具有高亲和力、高特异性、穿透力强、分子量小等特点。二者同时皆是小分子核酸，免疫原性低，因此适体介导的siRNA干扰技术是一种靶向性强，副作用小的治疗策略。

1 siRNA及其靶向运输载体

siRNA是长约21～25 nt的双链小分子RNA。siRNA通过RNA干扰（RNAi）途径能够使特定基因沉默或者表达水平降低[1]，从而阻断某种特定蛋白质的表达，因此siRNA具有成为新型核酸药物的潜力。目前siRNA类药物的研究已在多种疾病治疗领域取得了较大的进展。如今应用这种新药所面临的难题主要是如何使siRNA安全并稳定地传送到病变的靶细胞或靶组织中去。

经过多年的研究，已找到几种siRNA体内运输载体。有乳糖化脂质体[2]、胆固醇[3]、维生素E[4]、多肽[5]、由阳离子脂质构成的纳米颗粒[6]以及抗体[7]和适体等。其中，乳糖化的脂质体、胆固醇以及维生素E等可作为肝脏靶向载体，与siRNA结合，能有效地提高肝脏对siRNA的摄取[2,4]。但是这些载体不是针对某种特定的细胞，靶向性远远不如抗体和适体。抗体和适体可以既是载体又是靶标分子的配体。抗体由于具有高特异性，被认为是一种理想的送药载体。但是抗体是一类大分子蛋白，具有潜在的免疫原性，进入机体后可能诱导机体产生免疫反应，有一定的毒副作用，限制了抗体在这方面的应用。适体被称为是核酸形式的抗体，与抗体一样，适体同样具有对靶标分子的高特异性，但其分子量小，穿透力强，不存在明显的免疫原性，所以作为靶向载体比抗体更安全。

2 靶向载体：适体

适体是通过体外合成的一种单链DNA或RNA寡核苷酸，经体外指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术筛选得到[8]。近几年来，适体技术发展迅速，已有许多不同的蛋白或者细胞的适体经SELEX技术筛选得到。现今，适体作为靶向载体的研究日益受到关注。

适体一般由19～80个碱基构成，分子量为6～25 kDa。作为载体，适体具有以下几点优势：第一，高特异性和高亲和力。由于适体可折叠成独特的二级结构，从而具有特异、稳定的立体构象，所以适体对其靶标具有高特异性以及高亲和力[8]，其特异性甚至高于抗体。第二，穿透性强，免疫原性低。适体是一种小分子物质，更有利于其穿透组织或细胞，同时，适体无明显免疫原性，不会对机体产生毒副作用，用药更安全。第三，适体易于合成和修饰。如今适体已成功介导一些药物在体外和体内的靶向传递，这些药物除了siRNA[15,18～21,30]，还包括抗癌药[9～10]、毒素[11]、酶[12]、放射性核素[13]以及病毒[14]等等。

3 适体介导的siRNA传递

用适体介导siRNA传递，需要适体除了能特异性地与目的细胞上的靶分子结合，还能够引发细胞的内吞机制携带siRNA进入细胞。如今已有研究发现，几种靶标分子的适体可进入表达该分子的细胞中。这些靶标有PSMA[22]、CD4[23]、HIV糖蛋白gp120[18]、细胞粘合素C（TN-C）[24]、蛋白酪氨酸酶（PTK7）[25]、鼠转铁蛋白受体（TfR）[12]、核仁素（NCL）[9]以及粘蛋白1（MUC1）[10]等等。近几年来，多个小组对此进行了研究，利用针对CD30、CD4，PSMA、gp120等靶标的适体成功介导siRNA完成RNA干扰。最近的报道还介绍了针对B细胞激活因子受体（B cell activating factor-receptor，BAFF-R），以一段序列与siRNA相连，成功沉默了靶细胞的STAT3基因的表达[30]。

3.1 CD30适体介导的siRNA传递

CD30在间变性大细胞性淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）细胞表面特异性表达。间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因是ALCL细胞内特异表达的癌基因。Zhao等[6]用聚乙烯亚胺（PEI）和柠檬酸盐构成一个纳米内核，CD30的特异性核酸适体与目的基因为ALK的siRNA分别结合于PEI纳米内核的表面，形成一个纳米复合物。其中，PEI是一种阳离子聚合物，具有高转染效率，缓冲能力强，易于将核酸分子从核内体释放出来等优点，是一类理想的传递siRNA的载体。实验证明，纳米复合物能特异地使ALCL细胞的ALK基因的表达降低。通过这种设计可以将不同的siRNA或者药物通过纳米复合物的形式作用于肿瘤细胞，起到协同治疗的作用。因此，这种纳米复合物具有临床应用前景。

3.2 PSMA适体介导的siRNA传递

前列腺特异性膜抗原（prostate-speci fi c membrane antigen，PSMA）在原发性或者转移性前列腺癌细胞中高表达，而在正常的前列腺上皮细胞中不表达。PSMA是一种跨膜蛋白，可被内吞入细胞。Lupold等[22]用随机RNA库，以修饰后的胞外形式的PSMA为靶标，筛选出两种适体，A9和A10。已有报道证明这2种适体都可进入细胞，有研究利用这两种适体介导化疗药物、包被药物的纳米颗粒、毒素和siRNA等的靶向传递[11,15,16,26]。

Chu等[20]于2006年报道将靶标为PSMA的适体A9生物素化，而后分别与生物素化了的目的基因为A/C或GAPDH这两种基因的siRNA通过生物素和链霉亲和素之间的作用力结合，形成复合物。为了使得siRNA在进入细胞后更容易脱离出来，适体和siRNA之间以二硫键相连，当复合物进入细胞后，利用细胞内的还原环境，可使二硫键断裂，从而使siRNA解离。在细胞实验的结果显示，这个适体-生物素-链霉亲和素-生物素-siRNA复合物成功沉默了表达PSMA的LNCap细胞中A/C以及GAPDH基因的表达，而对PSMA阴性细胞PC3不产生明显的影响。这种方法虽然用适体成功将siRNA带入靶细胞，并沉默目的基因，但是链酶亲和素是大分子量的蛋白，进入机体后可能会诱导产生毒副作用。所以目前还无法应用于临床治疗。

McNamara等[16]找到另一种siRNA与适体的结合方式，即是直接将针对PSMA的适体A10与siRNA的正义链一起化学合成，形成长链，再将siRNA的反义链与长链中的siRNA正义链杂交，如此，通过共价键的形式相连形成嵌合体。在细胞实验结果显示，该嵌合体能特异地沉默LNCap细胞中的PLK1与BCL2基因。并且还通过动物实验，发现将嵌合体直接注射入裸鼠携带的LNCap肿瘤中，肿瘤体积明显减小，而PC3肿瘤未发现有明显的变化。实验结果证明了通过适体-siRNA结合体的连接方式，可成功介导siRNA靶向传递。这种嵌合体的成分只是RNA，具有免疫原性低，易于合成与修饰等优点，有利于在体内用药。

在此基础上，该研究小组对此嵌合体进一步优化[15]。首先，他们将PSMA-siRNA嵌合体的适体部分A10由原来的71 nt变为39 nt（A10-3.2），这样不仅大大降低核酸合成的成本而且简化了合成工序,有利于大规模的化学合成。第二步，在嵌合体长链的3'端加了2个尿嘧啶核苷酸尾（UU），这样有利于细胞内核酸内切酶DICER的识别。第三步，将siRNA部分的正义链和反义链位置交换，并在正义链（即短链）上加20 kDa的聚乙二醇（PEG），这样更有利于正确介导反义链进入RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。除此之外，20 kDa PEG使嵌合体的半衰期明显延长,从而大大提高siRNA的沉默效率。由此，在细胞实验中已验证得出优化后的结合体沉默效率提高了100倍。同时在动物实验中又证明了通过全身用药（腹腔注射）可使得肿瘤体积明显减小，并且优化后的嵌合体药效更持久。

为了提高适体介导的siRNA靶向传入细胞的效率，有研究将多个适体与siRNA相连。Wullner等[21]设计了两种由二价PSMA适体和siRNA构成的嵌合体。一种是把siRNA自身作为连接两个适体的连接体，另一种是将siRNA分别于两个适体的3'端。结果显示，与单价的适体-siRNA相比，具有二价适体的嵌合体由于进入靶细胞的能力增强，因而提高了嵌合体对目的基因EEF2的沉默效率。

3.3 CD4适体介导的siRNA传递

CD4是在T淋巴细胞表面表达的一种糖蛋白。是HIV进入宿主细胞的主要受体。Th细胞过表达的CD4蛋白可被内吞入细胞。Guo等[19]在2005年设计了一种利用噬菌体pRNA（packing RNA）将靶标为CD4的适体与siRNA结合的方法。pRNA的二级结构具有5'/3'环状结构（L环与R环），两个环状结构之间存在互补区域。将siRNA和适体分别与噬菌体pRNA相连，而后通过pRNA的环-环之间的碱基互补配对，siRNA与适体结合，形成二聚体。实验证明，这个二聚体可进入CD4（+）T淋巴细胞，并且成功沉默了目的基因。

最近，Zhu等[29]将CD4的RNA适体转变成DNA，二者被证明有相似的二级结构。将DNA形式的适体与siRNA直接化学合成，形成嵌合体。实验结果表明该DNA形式的适体具备与RNA适体相似的高亲和性和特异性，并成功介导了siRNA进入表达CD4的T细胞。

3.4 gp120适体介导的siRNA传递

gp120蛋白是HIV-1表面的囊膜蛋白，是一种糖蛋白，在HIV病毒与宿主细胞融合的过程中起着重要作用，当gp120与T细胞膜表面的CD4结合后，引发HIV-1进入细胞[27]。已有研究证明，gp120蛋白的适体能与HIV-1 gp120结合并且进入细胞，因此，gp120适体也是能够携带siRNA进入细胞的载体。Zhou等[17]将gp120适体与沉默HIV-1tat/rev基因的siRNA共价合成，为了降低空间位阻的影响，适体和siRNA之间存在一个4 nt的衔接子（linker）。由于gp120适体具有阻止HIV感染宿主细胞的功能，而siRNA又可通过RNA干扰途径沉默目的基因HIV-1tat/rev，所以这种嵌合体具有双重抗病毒作用。

Zhou等[28]设计了一种富含GC的“粘性寡核苷酸桥”。即是在适体的3'端通过化学合成，加上富含GC的一段寡核苷酸链。同时在siRNA的3'端加上与之互补的一段寡核苷酸链。二者通过互补配对相连。这种设计可以增加结合体的灵活性，不影响适体与siRNA各自的结构，并且在不影响适体结合细胞功能的前提下，使不同的siRNA与适体相连。除此之外，通过这种设计方法，将来可能扩展到把多个siRNA与一个适体相连，成为一种具有多重效应的多价嵌合体。

4 面临的问题与展望

用适体作为载体介导siRNA传递技术无疑为许多疾病的治疗提供新的治疗策略。但此技术目前还不成熟，其应用于临床主要面临如下几大问题：第一，一些复合物/嵌合体进入体内后可能会诱导机体对其产生免疫反应，存在潜在的危险性，所以要通过一些修饰优化或找到一种新的安全的载体来降低或者除去其免疫原性。第二，复合物/嵌合体在血清中会被核酸酶降解，因此要通过一些修饰来提高复合物/嵌合体的稳定性。第三，如今通过SELEX技术筛选出来的适体种类、数量有限，因此适体介导siRNA传递这项技术就只能对少数相应的几种疾病有效，大大限制了适体-siRNA复合物/嵌合体在临床上的应用。因此需要在未来建立一种新的筛选技术或改进现有的筛选技术以筛选出更多的针对不同靶标的适体。第四，适体-siRNA嵌合体一般是通过化学合成相连，如今的核酸合成技术只适用于合成小规模的寡核苷酸，而长链核酸的大规模、高质量化学合成目前还难以达到。因此要经过生物信息学分析后，将适体-siRNA嵌合体在不影响其功能的前提下长度尽量达到最短以简化合成工序并且节约成本。

5 总结

siRNA能通过RNA干扰途径沉默目的基因，是一类具有应用前景的基因类药物。但是用siRNA治疗疾病还存在靶向传递等问题。适体由于其具有高特异性，高亲和力等特点，是一种理想的介导siRNA靶向传递载体。但是，目前通过SELEX筛选技术得到的适体有限，需要在将来找到更有效的筛选技术筛选更多的适体，尤其是能够进入细胞的适体。除此之外，适体与siRNA如何相连也是研究的热点。这里要考虑到适体与siRNA连接产物不会影响到适体和siRNA各自的功能，甚至是增强其各自的功能，并且在体内给药时不容易被降解，同时不会引起机体产生免疫反应导致副作用等。如今，已有几种连接方法在细胞或动物实验证明有明显的治疗效果，但依然存在许多问题，需要从各方面优化，以用于临床。相信突破这些瓶颈，适体-siRNA复合物/嵌合体能广泛用于临床治疗。

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Research progress on aptamers as vector mediated siRNA targeted delivery

ZHANG Shimeng1, LIU Fei2, ZHENG Lei1, WANG Qian1★
(1.Laboratory Medicine Center, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.Clinical Laboratory, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangdong, Guangzhou 510623, China)

Small interfering RNA (siRNA) lead to gene silencing through RNA interference (RNAi) approach, which should be paid attention to the applicaion of disease treatment. Now the main problem about siRNA as drugs in disease treatment is how to transfer siRNA targeting to the target cell or tissue. Aptamer, a kind of single-stranded DNA or RNA oligonucleotides synthesized in vitro, has the characteristics of high speci fi city, strong penetrating, low immunogenicity, which can be used as vector for targeting delivery. This review mainly introduces the development of aptamer mediated siRNA delivery.

Aptamer; siRNA; RNA interference; Targeted delivery

1.南方医科大学南方医院，广东，广州 510515

2.广州市妇女儿童医疗中心检验部，广东，广州 510623

★通讯作者：王前，E-mail: wangqian@ fi mmu.com