应用DIBA快速检测番茄黄化曲叶病毒

季英华， 周晓伟， 张 晖， 周益军

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)

番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄上一种毁灭性的病毒，分类上属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，主要传播介体为烟粉虱(Bemisia tobaci)。该病毒早在1964年以色列就有发生危害报道［1］，近年来，随着全球气候变暖和耕作制度的改变以及国际间贸易的增加，TYLCV在全球范围传播，给番茄等作物的生产造成了严重危害［2-3］。2006年TYLCV在上海和浙江等地陆续出现危害，随后几年迅速扩展至江苏、安徽、山东、河南、河北、北京等地［4-8］。据各地植保部门的不完全统计，2009年中国番茄黄化曲叶病的年发生面积超过2.0×105hm2，遭受严重损失的面积在6.6×104hm2以上，经济损失超过5.0×109元。

在TYLCV检测上，比较常用的方法是基于PCR的分子检测［9-10］，该方法具有灵敏度高，检测时间相对较短等优势，但存在设备要求高、操作繁琐、成本较高等问题，很难应用于基层和大批量样品的检测，而病害的调查和预测预报往往需要检测大量样本，因此建立一种快捷、简便、高效而又成本较低的检测方法是一项迫在眉睫的任务。本研究拟建立一种基于DIBA(斑点免疫结合分析法)的TYLCV快速检测方法，旨在为病害的预测预报及病害调查提供支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试番茄病样为室内接种获得的TYLCV病株，健康番茄材料为实验室内培育的不含TYLCV番茄苗，田间样品于2011年采自江苏南京。

1.2 抗体和试剂

TYLCV单克隆抗体［11］由浙江大学周雪平老师提供;碱性磷酸酯酶(AP)标记的羊抗鼠IgG购自SIGMA;硝酸纤维素膜购自PALL;dNTP、Taq酶购自TaKaRa;显色底物BCIP/NBT购自上海生工生物工程有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.3 DIBA 检测方法［12］

(1)在硝酸纤维素膜上划0.5 cm×0.5 cm方格，根据试验样品数裁剪，1个样品用1个方格。(2)取植物样品0.1 g，加1 ml碳酸盐包被液，充分研磨;(3)低速离心3～5 min，取上清3～5 μl点膜，室温晾干;(4)用含3%脱脂奶粉的PBST缓冲液37℃封闭45 min;(5)将膜浸入含有单抗的PBST缓冲液(含3%脱脂奶粉)中37℃孵育1.5 h;(6)PBST洗膜3～4次，每次5 min;(7)加入AP标记羊抗鼠IgG(含3%脱脂奶粉的PBST缓冲液1∶6 000稀释)，37℃孵育1.5 h;(8)PBST洗膜3～4次，每次5 min;(9)将膜浸入显色底物BCIP/NBT中充分显色;(10)加双蒸水终止反应，观察记录结果。

1.4 单抗作用浓度的优化

单抗按1∶3 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶15 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000及1∶160 000稀释构建浓度梯度，DIBA检测后，根据试验结果选择最佳单抗浓度。

1.5 灵敏度检测

将植物样品研磨匀浆后得到的原液［鲜重(g)∶包被液(ml)=0.1∶1.0］按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶ 3 200、1∶6 400、1∶ 12 800、1∶ 25 600 及1∶51 200稀释构建浓度梯度，方法参照方法1.3，单抗浓度参照方法1.4，测定建立的DIBA方法检测样品的灵敏度，设3次重复。

1.6 准确性检测

对实验室内保存的确认感染TYLCV的番茄样品和健康番茄样品共抽选10份，分别用PCR方法［6］和DIBA检测，单抗浓度参照方法1.4，每个样品重复2次。根据两种方法的检测结果来评估建立的DIBA检测方法的准确性。

1.7 稳定性检测

利用已建立的DIBA检测方法，对同一批番茄样品(同时含有阳性和阴性)进行3次重复检测试验，每次重复中，每个样品研磨后在膜上重复点膜3次，根据3×3次重复的结果来判定检测方法的稳定性。

1.8 田间样品检测

大田随机采样，利用建立的DIBA方法对采集样品进行检测，根据检测结果来检验建立的DIBA方法对田间样品的检测能力。

2 结果

2.1 最适单抗浓度优化

在其他条件不变的前提下，对单抗进行稀释，发现当单抗稀释度在1∶3 000～1∶20 000时，利用DIBA方法可以很明显地区分样品，只是稀释度在1∶3 000时，阴性样品有少许显色。当单抗稀释到1∶40 000及以上时，阳性样品虽然也有显色，但是显色不明显。因此理论上单抗的稀释范围可以为1∶3 000～1∶20 000，推荐使用 1∶5 000～1∶15 000，本研究后续试验单抗稀释度采用1∶8 000。

2.2 灵敏度检测

将植物样品处理后的原液(鲜重(g)∶包被液(ml)=0.1∶1.0)进行稀释，对稀释样品进行检测，结果显示:在3次重复中，原液稀释到1∶800时，阳性样品还可以看到非常淡的显色，稀释到1∶1 600时基本上看不见显色，所以推测单抗检测植物样品的极限是1∶800，在检测样品时推荐采用原液或者原液稀释50倍。

2.3 准确性检测

对实验室内保存的感染TYLCV的番茄样品和健康番茄样品进行抽样检测，PCR检测结果显示10份样品中有6份样品为阳性;利用DIBA也检测到了6份，并且与PCR检测结果完全一致，说明建立的DIBA方法可以较准确地检测TYLCV。

2.4 稳定性检测

从实验室内保存的感染TYLCV的番茄样品和健康番茄样品中抽选8份进行DIBA检测，结果同一样品3次重复检测试验显色一致，同一样品研磨后3次重复点膜显色也一致，说明建立的DIBA方法检测TYLCV具有较好的稳定性。

2.5 田间样品检测

对2011年采自江苏南京日光温室的30份番茄样品进行检测，结果也表明建立的DIBA检测方法可以对田间样品进行有效检测。

3 讨论

对于TYLCV的检测方法，前人有很多报道，包括血清学、PCR 检测、核酸杂交检测等［9，13-16］，但是 DIBA 检测方法对于检测大批量样品有其无可比拟的优势。

在利用DIBA检测样品时，若直接采用原液(不稀释)，有时会有色素或杂质影响，建议在对粗样低速离心时适当延长离心时间或者选择相对较高的离心速度，这样可以较好地减少色素或杂质的影响。虽然本试验结果表明单抗稀释度在1∶3 000～1∶20 000时也能显色，但是在检测大量样品时推荐使用1∶5 000或者 1∶8 000稀释度，这样能较好地兼顾稳定性和灵敏度。很多研究结果显示大多数双生病毒的增殖部位局限于植物韧皮部组织［17-19］，我们在利用单抗对番茄不同部位的TYLCV进行Western-blot分析时也发现:韧皮部病毒的含量最高，推测检测时取样的最佳部位应该是韧皮部，但是韧皮部在检测时候会存在一些问题，比如采样不方便、样品处理较费时，因此本方法还是采用番茄叶片作为取样部位进行检测，该方法也同样适用于韧皮部组织的样品检测，而且可能会有更高的灵敏度。在检测大量样品时，比较DIBA与PCR的检测结果，有时会发现它们存在一些差异，这可能与二者的检测灵敏度、特异性等因素相关，但从目前我们对江苏及周边地区的样品检测结果来看，二者还是基本一致的。

在菜豆金色花叶病毒属中，与TYLCV序列接近的病毒有多种，利用单抗进行检测时也可能会检测到一些近缘的病毒，因此，田间调查时建议采用两步法:第一步，先DIBA检测;第二步，抽选DIBA检测结果中的阳性样品进行PCR检测。这样既提高了样品的检测量，又保障了样品检测的准确性。对于目前只有TYLCV发生地区，如江苏、安徽、山东等地，只用DIBA检测方法来检测TYLCV是可行的，同时也建议抽样进行PCR检测，以防有新病毒传入。

致谢: 本研究所用TYLCV单克隆抗体由浙江大学周雪平老师提供，在此表示衷心感谢!

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